Transcript Službeni glasnik SRS

* IDENTIFIKACIJA MIKROORGANIZAMA
* SAVREMENE METODE ZA IDENTIFIKACIJU
POJEDINIH GRUPA MIKROORGANIZAMA
* SANITARNI NADZOR I PROPISI
Doc. dr Slaviša Stanković – Katedra za mkrobiologiju
- Ozbiljan problem u analizi mikrobnih zajednica predstavljale su
konvencionalne mikrobiološke tehnike izolacije, kultivacije i
obogaćenja.
- Relativna proporcija bakterija gajenih na agar pločama (CFU) i
stvarnog broja bakterija u prirodi je velika.
- Zapaženo je da se tim metodama 99% vrta ne može kultivisati, što
je bio ozbiljan poziv za novi pristup i primjenu drugih metoda u
mikrobiologiji.
- Molekularne metode su predvidjele alat za potpunu analizu
bakterijskih zajednica.
Obogaćivanje kulture
• Specifični
mikroorganizmi se
mogu izolovati izborom
medijuma i uslova
gajenja koji favorizuju
rast određenog
metaboličkog tipa
• Medijum i uslovi
imitiraju uslove u
prirodi
Tehnika obogaćivanja kulture
• Medijum i uslovi inkubacije omogućavaju selektivni rast određenog
organizma i izolovanje specifičnih mikroorganizama iz različitih staništa
• Veliki broj različitih strategija obogaćivanja rasta
Aerobna inkubacija
N2 kao izvor azota
Cyanobacteria
NO3 kao izvor azota, 55°C
Termofilne cyanobacteria
Aerobna inkubacija
H2 ili organske kis, N2 kao
izvor azota
Purpurne nesumporne bakt.,
Heliobacteria
H2S kao donor elektrona
Purpurne i zelene sumporne
bakt.
Voda iz jezra, mulj bogat
sumporom, vlažno
zemljište izloženo svetlu
Topli izvori
Voda iz jezra, mulj bogat
sumporom, vlažno
zemljište izloženo svetlu
• Ruski mikrobiolog Sergej
Vinogradskij konstruisao je
kolonu (1880) za studiranje
mikoorganizama zemljišta
• Minijaturni anaerobni ekosistem
za izolovanje purpurnih i zelenih
fototrofnih bakterija i drugih
anaeroba
• Kolona, stakleni cilindar sa 1/3
organski bogatog mulja sa CaCO3
(pufer) i CaSO4 ( izvor sulfata) i
bez vazduha
• Nalije se vodom iz jezera, bare ili
nekog drugog vodenog staništa i
pokrije se folijom
• Smešta u blizinu izvora svetlosti
(nije direktna) i ostavlja nedelju
dana
• Veoma dugo izvor svih tipova
prokariota koji su uključeni u
kruženje elemenata
Kolona Vinogradskog
(ekosistem u malom)
Kolona Vinogradskog
• Alge i cijanobakterije – gornji deo
kolone (usled produkcije O2 ovaj deo
je aeroban)
• Sulfat-redukujuće bakterije - supstrat
se dobija fermentacijom materija iz
mulja (organske kiseline, alkoholi i
H2)
• Purpurne i zelene bakterije prisustvo sulfida omogucava im rast
u delu mulja koji je izložen svetlu
• Usled različite tolerancije na sulfid:
- Purpurne sumporne bakterije se
mogu javiti u gornjim slojevima
- Zelene sumporne bakterije u
donjim slojevima
• Uzorkovanje fototrofnih bakterija uranjanjem tanke pipete u kolonu i
uzimanjen obojenog dela mulja ili
vode.
Izolovanje čiste kulture iz obogaćene
kulture
• Išarana ploča
• Agar šejk tehnika - razređenja
mešovite kulture u epruvetama sa
rastopljenim agarom za izolovanje
anaeroba (fototrofne sumporne
bakterije i sulfat-redukujuće
bakterije iz kolone Vinogradskog)
• Nekoliko puta ponovljena
procedura MPN
MPN tehnika se koristi za grubo
određivanje broja
mikroorganizama
Optička pinceta
• Izolovanje jedne ćelije
pomoću laserskih
snopova
Provera čiste kulture
Identifikacija i kvantifikacija
Kombinacijom:
- mikroskopiranja
- karakterisktika kolonija
- provere rasta na različitim
medijumima, pre svega onim
na kojim ne treba da raste
Metoda razređenja i zasejavanja na
podlogu po uzorkovanju bakterija iz
vode i zemljišta
Samo deo ukupne zajednice može biti
određen na ovaj način.
Visoko selektivni medijumi se koriste za određivanje broja
specifičnih bakterija
Ako se mikroorganizmi ne mogu gajiti u laboratoriji postoje
specifične metode (antitela i sekvence nukleinskih kiselina).
Tehnike bojenja
• Fluorescentna boja
diamidofenilindol – DAPI, boji
DNK, koristi se za određivanje
ukupnog broja
• Akridin oranž boji DNK i RNK,
takođe se koristi za određivanje
ukupnog broja
• Kombinacija fluorescentnih boja
koje boje žive ćelije (zeleno) i
mrtve ćelije (crveno)
Fluorescentna antitela
• Visoka specifičnost antitela
pripremljenih za različite ćelijske
strukture određenog
mikroorganuzma
• Identifikacija i u veoma
komplesnom staništu kao što je
zemljište npr. Sulfolobus
acidocaldarius
• Genetičkim inženjerstvom
konstruisani mikroorganizmi koji
eksprimiraju fluorescentni protein
(FGP), za praćenje sudbine
introdukovanog mikroorganizma
Fluorescentna in situ hibridizacija - FISH
• “Filogenetske boje” su
fluorescentni oligonuklotidi
komplementarni baznim
sekvencama 16S ili 18S
rRNK
• Ove probe dospevaju u
ćeliju i hibridizuju se sa
ribozomalnom RNK
• Stepen specifičnosti
ovakvog bojenja je veoma
visok
• Mogu se identifikovati i
kvantifikovati različiti
mikroorganizmi u jednom
uzorku
Prednosti filogenetskog bojenja
Druge metode hibridizacije
• Bojenje hromozoma - florescentno obelezavanje gena, seta gena ili celog
hromozoma;
• In situ reverzna transkripcija ISRT – probe se hibridizuju sa iRNK pa se
reverznom transkripcijom sintetise komplementarna DNK. cDNA se umnoži
PCR-om i hibridizuje sa fluorescentnim probama - prati se ekspersija gena u
uzorku
Bojenje hromozoma: E. coli (crvene) i
Oceanospirillum linum (plave)
DAPI nespecifično bojenje (plave)
ISRT specifično obojene ćelije (crvene)
Studije biodiverziteta zajednice
mikroorganizama
• Ribozomalne RNA probe - informacija o
filogenetskom poreklu vrsta.
• Klonovi se mogu dobiti: “polymerase chain reaction”
(PCR), umnožavaju se rRNA geni, ili indirektno,
dobijanjem cDNA reverznom transkripcijom.
• Većina
filogenetskih
analiza
mikrobioloških
zajednica je pokazala da se sastoje od filogenetski
udaljenih mikroorganizama.
Kvalitativna i
kvantitativna analiza
mikrobijalnih
zajednica pomoću
PCR metode
DGGE
Rezultati PCR filogenetske analize
• Potkrepljuje se hipoteza da je biodiverzitet zajednice
mnogo veći od prvih predpostavki dobijenih na
osnovu određivanja broja i vrsta mo kultivacijom u
laboratorijskim uslovima.
• PCR filogenetske analize sa 16S rRNA su pokazale
da postoje velike razlike laboratorijskih kultura i
mikroorganizama iz prirode.
Metagenomika - Environmental genomics
• Uključuje sekvenciranje
i analizu gena svih
organizama koji se
nalaze u mikrobijalnoj
zajednici
Merenje metaboličkih aktivnosti mikroorganizama
• Veći broj metoda se
koristi za merenje
aktivnosti
mikroorganizama
• Određivanje
kolektivne aktivnosti
mikrobijalnih
zajednica
• Važne su negativne
kontrole
Radioizotopi
Kombinacija FISH i mikroautoradiografije
• Filogenetska proba + korišćenje
obeleženog 14CO2 ili glukoze
• Identifikacija mo koji vrši
određenu metaboličku aktivnost
Mešovita kultura E.coli i Herpetosiphon sp.
Autotrof iz grupe gama Proteobakterija
Mikroelektrode (pH, O2, N2O, CO2, H2, H2S)
• Molekularna mikrobiologija - primena molekularne tehnologije,
bazirane na poznavanju nukleotidnih sekvenci:
- molekularna mikrobiološka ekologija
- molekularna mikrobiološka sistematika
• Pregled, potencijal pojedinih metoda i primeri za njihovu primenu:
- pravilna identifikacija sojeva
- detekcija i praćenje sojeva
- selekcija novih sojeva
- kontrola kvaliteta
Sekvenciranje 16S rDNK – od roda do vrste
- Pouzdana,
brza,
visoko
diskriminativna i senzitivna
metodologija
- Različiti nivoi hijerarhije – od
roda do vrste i podvrste
Filogenetske
studije
omogućene
zahvaljujući
postojanju baza podataka sa
preko 100,000 sekvenci
- Razvijeni softveri za analizu i
poređenje nukleotidnih sekvenci
Pregled molekularnih metoda za identifikaciju
mikroorganizama
• Karakterizacija ekoloških zajednica mikroorganizama (DGGE,
TGGE)
- hemijska gradijentna gel elektroforeza (DGGE)
- temperaturna gradijentna gel elektroforeza (TGGE)
•
-
Genotipizacija: identifikacija sojeva
repetitive extragenic palindromic PCR (rep-PCR)
randomly amplified polymorphic DNA (RAPD)
restriction fragment length polymorphism (RFLP)
pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)
amplified fragment length polymorphism (AFLP)
fluorescent in situ hybridization (FISH)
• Molekularna dijagnostika mikroorganizama - multipleks PCR
Pristupi za analize mikrobnog diverziteta.
Boldovana polja predstavljaju okvir
procedure koji predhodi izvođenju
detekcije.
Polja
tankih
linija
predstavljaju tehnike detekcije.
FISH i in situ PCR mogu se koristiti
direktno, dok za druge tehnike, mora se
prvo ekstrahovati DNK.
Dot-plot hibridizacija može koristiti
ukupnu DNK ili amplifikovane
fragmente pomoću PCR-a.
Procjena strukture zajednica može se
postići
analizama
PCR-produkta,
kloniranjem i sekvencioni-ranjem,
hibridizacijom
ili
korišćenjem
kombinacije ovih tehnika
-Molekularne metode koje se sve više koriste za genetičke analize bakterijskih zajednica
su:
(1) t-RFLP – polimorfizam fragmenata restrikcije,
(2) ARDRA –analiza restrikcije ribosomalnih DNK molekula,
(3) RISA – analiza ribosomalnih međugenskih nukleotidnih parova,
(4) RAPD – polimorfizam umnožaka DNK,
(5) DGGE (hemijska gradijentna gel elektroforeza) i
(6) TGGE (temperaturna gradijentna gel elektroforeza).
- Metode DGGE i TGGE mogu detektovati varijacije u sekvenci fragmenata DNK reda
veličine 500 bp. Problem ovih metoda je veoma zahtevna optimizacija.
- Metod DDGE se široko primjenjuje za analize bakterijskih zajednica i bakterijskog
biofilma u zemljištu, jezerima i drugim prirodnim sredinama.
- Tehnikama DDGE i TTGE mogu se detektovati i specifične mutacije u humanom
genomu.
Karakterizacija izolata
1. ukupna zajednicaa; 2. 75; 3. 76; 4. 14; 5. 2-16; 6. 4; 7. 19; 8. 124; 9. E. faecalis
Karakterizacija izolata
A
B
1 2 3 4
GTG-PCR profil (A) laktokoka i enterokoka
5 6 7
8 9
Lična karta mikroorganizama
Analiza prisustva industrijski značajnog gena (izg)
izg 2
Soj 1
+
Soj 2
+
izg3
izg4
izg 7, izg
8
+
+
+
+
+
+
Soj 3
izg 9
+
Soj1
Soj2
Soj1
Soj2
RAPD
Soj3
PFGE
Soj 3
+
Soj 3
izg1
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Query
18
Sbjct
Query
613
78
Sbjct
Query
672
138
Sbjct
Query
730
198
Sbjct
Query
790
258
Sbjct
Query
850
318
Sbjct
Query
910
378
Sbjct
Query
970
438
Sbjct
Query
1030
498
Sbjct
Query
1090
558
Sbjct
Query
1149
618
Sbjct
1209
TTACGTACGTATCGAGATTACTNTGANAAATTATACAAGAGATTATTCTAATTATTGTAT 77
||||||||||||||||||||| ||| |||||||||||||||||||||||||||||||||
TTACGTACGTATCGAGATTAC-CTGAGAAATTATACAAGAGATTATTCTAATTATTGTAT 671
AAATACGTATCAAACTGCGTTTAGAGGTGTTAAACACNCCGTTTACACGATATGTTAGAA 137
||||||||||||||||||||||||||| ||||||||| ||||||||||||||||||||||
AAATACGTATCAAACTGCGTTTAGAGG-GTTAAACAC-CCGTTTACACGATATGTTAGAA 729
TTTAGAACATATATGTTTTTAAATGTATTTGAATATGTATCCATTTGGTCATTGTTTAAA 197
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TTTAGAACATATATGTTTTTAAATGTATTTGAATATGTATCCATTTGGTCATTGTTTAAA 789
TATCAAAGTCTTATGGTATCTTCTGGCGCTAATTTATATGCTAGCGGTAGTGGACCACAG 257
||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TATCAGAGTCTTATGGTATCTTCTGGCGCTAATTTATATGCTAGCGGTAGTGGACCACAG 849
CAGACCCAATCATTTACTTCACAAAACTGGCCATTTTTATATTCTCTTTTCCAAGTTAAT 317
||||| ||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
CAGACACAATCATTTACAGCACAAAACTGGCCATTTTTATATTCTCTTTTCCAAGTTAAT 909
TCAAATTATGTGTTATCTGGAATTAGTGGTGCTAGGCTTTCTATTACCTTCCCTAATATT 377
|| |||||| | |||||||| ||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||
TCGAATTATATATTATCTGGTATTAGTGGTACTAGGCTTTCTATTACCTTCCCTAATATT 969
GGTGGTTTACCGGGTACTACTACAACTCATTCATTGAATGCTGCCAGGGTTAATTATAGC 437
|||||||||||||||| |||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||
GGTGGTTTACCGGGTAGTACTACAACTCATTCATTGAATAGTGCCAGGGTTAATTATAGC 1029
GGAGGANTTTCATCTGGTCACATAGGGGCGACTAATCTCAATCACAACTTTAATTGCAGC 497
|||||| |||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GGAGGAGTTTCATCTGGTCTCATAGGGGCGACTAATCTCAATCACAACTTTAATTGCAGC 1089
ACGGTTCCTCCCTCCTTTATCAACACCATTTGTTAGAAGTTGGCTGGATTCAGGTTCAGA 557
|||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||
ACGG-TCCTCCCTCCTTTATCAACACCATTTGTTAGAAGTTGGCTGGATTCAGGTACAGA 1148
TCGAGAGGGCGTTGCTACCTCTACNAATTGNCNNACAGAATCCTTTCAAACAACTTTAAG 617
|||||||||||||||||||||||| ||||| | ||||||||||||||||||||||||||
TCGAGAGGGCGTTGCTACCTCTACGAATTGGCAGACAGAATCCTTTCAAACAACTTTAAG 1208
GTTAAGGAGTGGTGCTTTTTCATCCCGTGNAAATTCAAACTATTTCCCAGATTATTTTA 676
|||||| |||||||||||||| |||||| |||||||||||||||||||||||||||||
TTTAAGGTGTGGTGCTTTTTCAGCCCGTGGAAATTCAAACTATTTCCCAGATTATTTTA 1267
Molekularno epidemiološka analiza prisustva Listeria
monocytogenes...
M C
0h
2h
6h
24h
1 2 3 4
5 6 7 0 - + M
M
1
2
3
4
Lm
Li
Službeni glasnik SRS (1968): Uredba o kategorizaciji vodotoka, broj 5.
Službeni list SFRJ (1978): Uredba o klasifikaciji voda međurepubličkih vodotoka,
međudržavnih voda i voda obalnog mora Jugoslavije, broj 6.
Službeni glasnik SRS (1978.): Pravilnik o načinu određivanja i održavanja pojaseva
sanitarne zaštite objekata za snabdevanje vodom za piće, broj 33.
Službeni glasnik SRS (1981.): Pravilnik o dezinfekciji i pregledu vode za piće, broj 60.
Službeni glasnik SRS (1982.): Pravilnik o opasnim materijama u vodama, broj 31.
Službeni list SFRJ (1987.): Pravilnik o načinu uzimanja uzoraka i metodama za
laboratorijsku analizu vode za piće, broj 33.
Službeni glasnik RS (1991.): Plan za zaštitu voda od zagađivanja, broj 6.
Službeni glasnik RS (1991.): Zakon o vodama, broj 46.
Službeni glasnik RS (1998.): Pravilnik o higijenskoj ispravnosti vode za piće, broj
42.
Klasa boniteta ( Kohl 1975.)
Prema brojnosti ukupnih heterotrofnih bakterija, vode se svrstavaju u četiri
osnovne klase, sa prelaznim kategorijama:
broj saprofitnih bakterija po cm3
< 500
500-1000
1000-10000
10000-50000
50000-100000
100000-750000
> 750000
klasa vode
I
I-II
II
II-III
III
III-IV
IV
Indeks O/H (Petrović et al 1998.)
Na osnovu odnosa brojnosti ukupnih oligotrofnih i heterotrofnih
bakterija, procenjuje se sposobnost samoprečišćavanja vode.
vrednost indeksa O/H
<1
>1
>10
sposobnost samoprečišćavanja voda
slaba
zadovoljavajuća
dobra
Stepen saprobnosti
(Pantle-Buck 1955.)
Na osnovu vrednosti Indeksa saprobnosti određuje se Stepen
saprobnosti vode, tako što:
-odsustvo planktonskih vrsta (indeks saprobnosti 0) označava katarobni stepen
saprobnosti vode
-vrednosti indeksa od 1 do 1,5 označavaju oligosaprobni stepen saprobnosti
vode
-vrednosti indeksa od 1,5 do 2,5 označavaju βmezosaprobni stepen saprobnosti
vode
-vrednosti indeksa od 2,5 do 3,5 označavaju mezosaprobni stepen
saprobnosti vode
-vrednosti indeksa od 3,5 do 4 označavaju polisaprobni stepen saprobnosti
vode
Stepen trofičnosti
(Felfoldy 1980.)
Na osnovu koncentracije hlorofila-a dati su stepeni trofičnosti
vodenog ekosistema:
stepen trofičnosti:
koncentracija hlorofila-a mg/m3
0 atrofičan
1 ultra oligotrofičan
2 oligotrofičan
3 oligo-mezotrofičan
4 mezotrofičan
5 mezo-eutrofičan
6 eutrofičan
7 eu-politrofičan
8 politrofičan
9 hipertrofičan
0
<1
1-3
3-10
10-20
20-50
50-100
100-200
200-800
>800
Kategorizacija na osnovu IFA (Matavulj 1986.)
Na osnovu vrednosti Indeksa fosfatazne aktivnosti, mogu se izdvojiti
sledeće kategorije voda:
<0,01
0,01-0,1
0,1-0,25
0,25-0,50
0,50-1.00
1.00-2,50
2,50-5.00
5.00-7.50
7.50-10.00
10.00-15.00
>15.00
IA
IB
I-II
IIA
IIB
II-III
IIIA
IIIB
III-IV
IVA
IVB
maksimalno čista
veoma čista
čista
zadovoljavajuće čista
slabo zagađena
umereno zagađena
zagađena
veoma zagađena
prljava
veoma prljava
maksimalno prljava