Transcript Molekulárna diagnostika infekčných ochorení CNS

Molekulárna diagnostika
infekčných ochorení CNS
MVDr. Katarína Domaracká, PhD.
MVDr. Monika Novikmecová
MUDr. Iveta Fandáková
MUDr. Zuzana Szövényiová
Princíp: PCR-polymerázová
reťazová reakcia
Polymerázová reťazová reakcia (PCR, polymerase chain
reaction) umožňuje selektívne zmnoženie (amplifikáciu)
určitej oblasti DNA spôsobom podobným in vivo DNA
replikácii, pričom veľkosť amplifikovaného úseku
ohraničujú dva oligonukleotidy – primery.
(1985, Kary Mullis)
Cieľová dvojvláknová DNA
Počiatočná denaturácia
DNA 94-95°C, 5´
Mechanizmus PCR
reakcie
“Annealing” primerov
30-60°C, 30´´
Primery sú predĺžované
prostredníctvom
aktivity Taq polymerázy
Nové reťazce
74°C, 2-5´
´n´cykly sa opakujú
Denaturácia DNA 95°C, 30´´
VZORKA
IZOLÁCIA DNA, RNA
AMPLIFIKÁCIA
DETEKCIA
Využitie PCR v diagnostike
infekčných ochorení
baktérie
Bordettella pertusis, Borrelia burgdorferi,
Mycoplasma sp., Chlamydia sp.,
Ureaplasma sp., Neisseria gonorhoeae,
Mycobacterium sp........
vírusy
CMV, HSV, EBV, rotavírusy, adenovírusy
papilomavírusy, hepatitída B a C...
fungi
faktory virulencie, gény rezistencie
CSF ako vzorka pre PCR
jedna z najúspešnejších aplikácií PCR pri
diagnostike infekcií CNS
PCR- ideálna pre dg. ťažko kultivovateľných
mikroorganizmov
možnosť pozitívneho nálezu aj po aplikácii nízkych
dávok antivirotík (inhibujú tradičné kultivácie)
časová výhoda oproti sérologii (tvorba protilátok
trvá 2-4 týždne), PCR zachytí vírus v čase
najvyššej replikácie
Senzitivita PCR v CSF
nízka senzitivita (falošná negativita)
príčiny:
- nízka hladina vírusu vo vzorke
- „clearance“- silné neutralizujúce protilátky
- inhibítory = produkty rozpadu erytrocytov
!PCR neovplyvňuje xantochrómia, vysoká
hladina bielkovín a leukocytov !!!
Špecificita PCR v CSF
pozitívny výsledok indikuje prítomnosť nukleovej
kyseliny vírusu (súčasná alebo pretrvávajúca
vírusová infekcia)
Výnimky! (pozitívny výsledok neindikuje vírusovú
infekciu – falošná pozitivita)
- porušenie hematoencefalickej bariéry
(bakteriálna meningitída, kontaminácia krvou)
- prítomnosť infikovaných Leu (CMV)
Diagnostika herpesvírusových
infekcií CNS
!Zlatý štandard pre diagnostiku herpesvírusových
infekcií CNS!
(DeBiasi a kol, 2004)
problém: pretrvávanie latentných
herpesvírusov u zdravej populácie
(ich genóm je cieľ pre PCR)
!Dôležité zvážiť výskyt pozitívneho nálezu!
Herpes simplex vírus 1 a 2
HSV1 aj HSV 2 – najčastejšia komplikácia
postihnutie CNS
HSV1 – najčastejšia endemická encephalitis v
rozvinutých krajinách
pozitívny PCR výsledok pre HSV (1/2)
korešponduje vždy s klinickým obrazom a je
„gold standard“ pre diagnózu, s približne 96%
senzitivitou a 99% špecificitou (Boivin a kol. ,
2004)
Kinetika HSV pozitivity v CSF
prvotné štúdie – pozitívny výsledok hneď po
infekcii
novšie - 3 z 11 pac. negatívny výsledok počas
prvých 72 h
nevhodné hodnotiť negatívny výsledok počas
prvých 72 hodín, PCR test má byť opakovaný na
4 až 7 deň po objavení symptómov
nevhodné prerušiť terapiu antivirotikami na
základe negatívneho výsledku do 72 hod. (Weil
a kol, 2002)
u pacientov so symptómami viac ako jeden až
dva týždne simultánne PCR a sérologia
Vplyv terapie na PCR pozitivitu
HSV v CSF
Lakemann a kol. dĺžka antivirot. terapie:
- 1 týždeň – žiaden vplyv na pozitivitu
- 8-14 dní - 47% pozitivita
- viac ako 2 týždne - 21% pozitivita
ak je PCR pozitívna 10 až 14 dní po
ukončení terapie acyklovirom – ďalšia
terapia (Cinque a kol. 2002)
PCR diagnostika CMV
kvalitatívna : latentní nosiči
- moč,krv + EDTA (!nie citrát ani heparín!),CSF
- plodová voda, punktáty, BAL, stery oko, sliny
!Problém: odlíšiť latentnú a akútnu infekciu na základe PCR
diagnózy!
 kvantitatívna PCR (real-time PCR)
- monitoruje fluorescenciu emitovanú počas reakcie ako
indikátor produkcie amplikónov v každom PCR cykle (v
reálnom čase)
- umožňuje kvantifikovať hladinu virémie v krvi, čím
nepriamo monitoruje účinnosť terapie
EBV
hodnotenie pozitívneho PCR výsledku EBV v
CSF je stále nejasné
DNA EBV je často detekovaná aj pri absencii
neurologických porúch
Výnimka!
AIDS - associated primary CNS lymfoma
(citlivosť 83-100 %)
(špecificita 88-100%)
(Boivin a kol. 2004)
CSF- manipulácia a odosielanie
pre analýzu potrebné minimálne množstvá
CSL, senzitivita závislá na objeme vzorky
200 - 300 ul – ideálne množstvo
optimálne - čerstvé vzorky doručené čo
najrýchlejšie po odbere!
krátkodobé skladovanie -20°C, (1-2 dni)
Pomocou metódy PCR
vyšetrujeme aj nasledujúce
patogény:
Chlamydia trachomatis
Ureaplazma urealyticum + parvum
Mycoplasma spp.
(Mge+Mho+Mpn+Mfe+Mpe)
HPV „high risk“ (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45)
Neiseria gonorhoeae
Pneumocystis jiroveci (pôv. carinii, 4. porcia BAL)
Lymská borelióza (LB)
Borrelia burgdorferi sensu stricto (USA)
Borrelia garini
Borrelia afzelii
Európa – B. senzu lato
- rád Spirochaetales gramnegatívne,špirálovité
mikroaerofilné ťažkokultivovateľné baktérie
- antropozoonóza (kliešte, lietajúci a savý hmyz)
- unikátna baktéria z mikrobiologického aj z
molekulárneho hľadiska (najviac plazmidov),
umožňuje jej prežiť v prostredí
bezstavovcov aj stavovcov
Laboratórna
diagnostika boreliózy
nepriama
(sérologická)
priama
ELISA, western blot
PCR (dôkaz DNA), kultivácia,
elektrónová mikroskopia
Nepriama - sérologická diagnostika
1. stupeň (IF, ELISA) detekcia IgM a IgG protilátok
- ELISA IV generácia, obsahuje VslE atg príp.
jeho konzervatívnu doménu C6
- v ojedinelých prípadoch pozorujeme
skríženú reaktivitu s EBV, iné herpetické
alebo spirochétové infekcie
2. stupeň IMUNO BLOT ( Western blot)
- konfirmácia špecificity protilátok !!!!
- v prípade nepriekaznej klinickej symtomatológie
a pozitivity protilátok v sérologických reakciách
western blot- v prípade nepriekaznej klinickej symtomatológie a
Antigén
pozitivity protilátok v sérologických reakciách
p100
- IgM - OspC - tvorí sa po
p58
BmpA
VlsE
OspC
vniknutí do organizmu
Bičíkové proteíny
(flagelín p41)
- IgG - VslE – lipoproteín,zodpovedá
za únik pred imunitou má
kozervatívnu doménu C6
DbpA (Osp17, p18), DbpB
p41i
DbpA
OspA + OspB - povrchové proteíny
ktoré borélia tvorí aby unikla imunite
kliešťa, prípadne imunite hostiteľa
Obr. IgG imunoblot pacientov s neuroboreliózou
(Wilske a kol.2007)
LB-priama diagnostika
PCR –plazmidová, chromozomálna DNA
biopsia kože, moč –
- v štádiách EM (erytema migrans) a ACA (acrodermatitis
chronica atroficans) - vysoká senzitivita
synoviálna tekutina – vysoká senzitivita
CSF - odporúča sa vo včasných štádiách LNB
- najvyšší záchyt DNA borelií je do 6 týždňov
od výskytu prvých symptómov ochorenia
- v neskorších štádiách neuroboreliózy senzitivita
metódy klesá (EFSN guidelines, 2010)
!!!!!!PRE PCR DIAGNOSTIKU LB SA NEODPORÚČA POUŽIŤ KRV
ANI SÉRUM!!!!!!!
Výhody PCR v diagnostike
infekčných ochorení
vysoká senzitivita (1-10 baktérií
10-100 PFU/vzorka)
vysoká špecificita (daná sekvenciou primerov)
minimálne množstvo vzorky (výnimka moč)
detekcia perzistentných infekcií, asymtomatických
infekcií
detekcia ťažko kultivovateľných mikroorganizmov
rýchlosť
Nevýhody PCR
INTERPRETÁCIA
informácia len o kvalite (!výnimka kvantitatívna PCR!)
! to znamená DNA je, alebo nie je vo vzorke prítomná!
neinformuje o:
- imunitnej odpovedi organizmu
- citlivosti na antibiotiká
detekuje aj prítomnosť mŕtvych mikroorganizmov vo vzorke
(Chlamydia trachomatis viac ako 3 týždne po ukončení
liečby doxycyklínom, Bauwens a kol. 1993)
vysoké riziko kontaminácie pri odbere a spracovaní vzorky
prítomnosť inhibítorov vo vzorke (talk, heparín...), falošne
negatívne výsledky (duplicita odberu)
finančná a technologická náročnosť
[email protected]
Adresa:
Rastislavova 43
Košice
Tel. kontakt: 055 / 615 23 74
615 23 75
615 23 76