Transcript Mikrobioloski preparati

Mikrobiološki
preparati
Mikrobiološki preparati
-
mikrobiološke preparate pravimo u cilju posmatranja
MO (morfologija, struktura, oblik, raspored ćelija,
pokretljivost…)
Preparat može da bude:
1. Nativni preparat - posmatranje živih MO
2. Fiksirani preparat
Nativni preparat
•
•
•
posmatranje živih MO (pokretljivost)
nedostatak-slaba vidljivost, mogućnost infekcije,
jednokratna upotreba
procedura pripreme:
1.
2.
3.
na predmetnicu se stavlja uzorak (u slučaju tečne kulture
stavlja se kap suspenzije, u slučaju čvrste podloge u kap
fiziološkog rastvora unosi se materijal iz kulture)
pokrovnica
mikroskopiranje
Nativni preparat
Fiksirani preparat
•
•
prednosti-višekratna upotreba, ne postoji
mogućnost infekcije, posmatranje strukture, oblika i
morfologije, ćelije lakše uočljive
procedura pripreme:
1.
2.
3.
4.
5.
nanošenje suspezije na predmetnicu i pravljenje razmaza
sušenje na vazduhu
fiksiranje (provlačenjem kroz plamen) kako bi ubili MO i
fiksirali ih za predmetnicu
bojenje preparata
mikroskopiranje
Pravljenje razmaza
Fiksiranje preparata
Bojenje preparata
1. Prosto bojenje - koristi se 1 boja
-uocavanje oblika i rasporeda celija
-boje koje se primenjuju: kristal violet, safranin,
metilensko plavo…
2. Slozeno bojenje - koristi se 2 ili vise boje
-uocavanje morfologije i strukture celije
-tipovi slozenog bojenja: bojenje po Gramm-u,
bojenje acido-alkohol rezistentnih bakterija
,bojenje kapsula, bojenje endospora, bojenje
nukleinskih kiselina, bojenje flagela
Mikrobiološke boje
•
•
1.
2.
•
1.
2.
3.
organska jedinjenja koja boje odredjene ćelijske
strukture
Prema poreklu dele se na:
prirodne: šafranin (šafran), lakmus (lisajevi)
veštačke (anilinske boje)
soli koje prilikom pravljenja vodenih rastvora
disosuju:
bazno – katjonske boje (kristal violet, šafranin…)
kiselo – anjonske boje, negativno bojenje (eozin)
neutralno-neutralno crveno
Mikrobiološke boje
•
Svaka boja mora da sadrži dve grupe:
1. hromoformnu (nosilac karaktera boje, NO2)
2. auksohromnu (el. disocijacija, OH¯, NH2)
Prosto bojenje
•
1.
2.
3.
4.
Procedura:
Pravljenje razmaza
Sušenje (na vazduhu)
Fiksiranje
Bojenje
-kristal violetom (na predmetnicu staviti filter hartiju i na
nju naneti boju, nakon 1-2 min ukloniti filter hartiju,
preparat isprati vodom, osušiti filter hartijom,
mikroskopiranje)
-šafraninom-postupak je identičan, filter hartiju nije
neophodno stavljati na preparat pre bojenja
Procedura prostog bojenja
Preparat-prosto bojenje
Složeno bojenje-bojenje po
Gramm-u
• 1884. danski histolog Christian Gram razvio metod
bojenja u cilju diferencijacije bakterijskih ćelija i
nukleusa eukariotskih ćelija
• diferencijalna slika (identifikacija Gr+ i Gr- bakterija)
• na osnovu razlike u gradji cel. zida Gr+ bakterije boje
se ljubičasto, dok se Gr- bakterije boje crveno
• metoda se zasniva na sukcesivnoj primeni
–
–
–
–
kristal violeta (osnovna boja)
lugola (učvršćivač) – rastvor I u KI
etanola (obezbojivač) 70% ili 95%
šafranin (suprotna boja)
Procedura bojenja po Gramm-u
•
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Nakon pravljenja razmaza, sušenja na vazduhu i
fiksiranja pristupa se proceduri bojenja preparata
bojenje kristal violetom 1-2 min (neophodno je
staviti na preparat filter hartiju)
lugol 1-2 min
ispiranje vodom
ispiranje etanolom 5-10 sec
ispiranje vodom
bojenje šafraninom 1-2 min
ispiranje vodom, susenje filter hartijom,
mikroskopiranje
Procedura bojenja po Gramm-u
Procedura bojenja po Gramm-u
nakon pravljenja razmaza, sušenja na
vazduhu i fiksiranja pristupa se proceduri
bojenja preparata
inicijalno se boje kristal violetom kako
Gr+ tako i Gr- bakterije
u reakciji kristal violeta i joda
obrazuje se nerastvorljivi
kompleks
Gr+ bakterije imaju deblji mureinski sloj
u ćelijskom zidu, nepropustljiv za
alkohol i boje se ljubičasto
Gr- bakterije imaju tanji peptidoglikanski
sloj u ćelijskom zidu, propustljiv za alkohol
koji rastvara i izvlači kompleks boje i joda
Razlika u gradji ćelijskog zida Gr+ i Grbakterija
Preparat-bojenje po Gramm-u
Sporulacija
• neke bakterije tokom rasta, procesom sporogeneze formiraju
endospore
• rezultat nepovoljnih uslova životne sredine, najčešće u uslovima
limitiranosti nutrijentima (C, N najznacajniji)
• karakteristike spora: odsustvo metaboličke aktivnosti,
rezistentnost prema fizičkim i hemijskim činiocima (t°, UV, boje,
hemijska jedinjenja, suša…) zbog prisustva egzosporijuma
(proteinski omotač)
• u povoljnim uslovima procesom germinacije formira vegetativnu
ćeliju
• jedna bakterijska celija najčešće formira samo 1 sporu
• strukture koje služe za preživljavanje, a ne za razmnožavanje
Sporulacija
•
•
•
•
rezistentnost na toplotu pripisuje se dehidriranom stanju i
kalcijum dipikolinatu
gradja spore: jezgro, zid, korteks, omotač, egzosporijum
proces sporulacije odvija se u najmanje 7 faza
tipovi sporulacije:
1. bacilarni-spora manjeg dijametra od ćelije (terminalno,
subterminalno ili centralno postavljena)
2. klostridijalni-spora većeg dijametra od ćelije (centralno
ili subterminalno postavljena)
3. plektridijalni-spora većeg dijametra od ćelije (terminalno
postavljena)
Faze sporulacije
Bacilarni, klostridijalni i
plektridijalni tip sporulacije
Bojenje endospora po SchaefferFulton-u
• zbog specifičnih fizičkih i hemijskih karakteristika
spore teško usvajaju mikrobiološke boje (uočavaju se
kao bezbojne intracelularne tvorevine kod prostog i
bojenja po Gramm-u)
• zagrevanjem preparata zid spore postaje propustljiv
za boju, nepropustljivost zida omogućava da prilikom
obezbojavanja alkohol ne prodire u sporu i ona ostaje
obojena za razliku od drugih vegetativnih oblika
bakterija
Bojenje endospora po SchaefferFulton-u
•
•
1.
2.
3.
4.
5.
•
Nakon pravljenja razmaza, sušenja na vazduhu i fiksiranja,
pristupa se bojenju preparata
Procedura bojenja:
Bojenje malahitno zelenom bojom (5%) 2min, neophodno je
koristiti filter hartiju
Zagrevanje predmetnice na plamenu 3-5min (boja treba da
isparava, ali ne da ključa), kada ispari veći deo boje doda se
nova količina
Ukloniti filter hartiju i ispirati vodom
Bojenje safraninom 3-5min
Ispiranje vodom, sušenje filter hartijom, mikroskopiranje
Spore se boje zeleno, a vegetativne ćelije crveno
Procedura bojenja endospora
Bojenje acido-alkohol rezistentnih
bakterija po Ziehl-Neelsen-u
• bakterije koje na svojoj površini imaju voštane
materije mogu se lako izdvojiti od drugih bakterija u
razmazu
• one primaju boju, ali se boja ne može isprati pod
dejsvom alkohola i kiselina (acido-alkohol rezistentne)
• bakterije bez voštanih materija na površini gube boju
tokom ispiranja
• acido-alkohol rezistentne bakterije na preparatima
imaju crvenu boju, dok sve ostale imaju plavu boju
• Acido-alkohol rezistentne bakterije: rod
Mycobacterium, rod Nocardia
Procedura bojenja acido-alkohol
rezistentnih bakterija
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
na fiksirani razmaz stavlja se filter hartija preko koje
se naliva boja karbol fuksin
predmetnica se blago zagreva iznad plamena tako da boja
isparava, ali da ne ključa (topi se voštana ovojnica i
omogućava prodiranje boje), kada veći deo boje ispari
dodaje se nova količina, postupak se ponavlja u toku 5min
ispiranje vodom
obezbojavanje smešom etilena i kiseline (HCl ili H2SO4)
20-30sec
ispiranje vodom
bojenje metilensko plavim 1-3min
ispiranje vodom, susenje u filter hartiji, mikroskopiranje
Procedura bojenja acido-alkohol
rezistentnih bakterija
Negativno bojenje
• podrazumeva upotrebu 1 kisele boje
• boji se pozadina oko ćelija kako bi se lakše uočile
veličina, oblik i organizacija celije
• ćelije ostaju ne obojene
• bakteriološki razmaz se ne fiksira toplotom (tačnija
predstava oblika i veličine ćelije)
• primenjuje se prilikom bojenja spirila i spiroheta, koje
običnim postupkom prostog bojenja teže primaju boje
Procedura negativnog bojenja
1.
2.
3.
4.
5.
na predmetnicu se stavlja kap nigrozina (tuša)
bakterijske ćelije se prebacuju u kap nigrozina (ili
tuša)
drugom predmetnicom pravi se razmaz, prevlačeći
je preko predmetnice sa uzorkom pod uglom od 45°,
druga predmetnica se koristi kako bi se napravio
tanak film ćelija
razmaz se susi na vazduhu
mikroskopiranje
Procedura negativnog bojenja
Preparat-negativno bojenje
Bojenje kapsula
• neke bakterije tokom rasta formiraju kapsulu (glikokaliks)
oko ćelije
• štiti bakterijsku ćeliju od fizičkih i hemijskih faktora
sredine, fagocitoze i predstavlja pomoćnu strukturu
prilikom pripajanja ćelije za površinu u njihovoj sredini
• kapsula-polisaharidna, redje polipeptidna struktura, faktor
patogenosti, uočava se primenom kombinovane tehnike
negativnog i prostog bojenja
• tehnikom negativnog bojenja boji se pozadina primenom
kisele boje (nigrozin, tus, eozin), dok se tehnikom prostog
bojenja boje ćelije
• razmaz se ne fiksira da se ne bi uništila kapsula, pa se ne
preporucuje ispiranje vodom ili se to čini krajnje pažljivo
da se bakterije ne speru
Bojenje kapsula
• da bi se izbegli ovi problemi bakterije se nakon
negativnog bojenja mogu fiksirati sa nekoliko kapi
metil alkohola
• pored ove metode koristi se i metoda bojenja razmaza
kristal violetom (1%) 2min, nakon čega se boja spira
20%-im rastvorom Cu2SO4, obojeni razmaz se ne ispira
vodom, suši se filter hartijom i mikroskopira,
bakterije su obojene tamno ljubičasto, a kapsule
plavičasto
Bojenje kapsula
Primeri prostog i slozenih bojenja