Transcript Genomisk DNA

Efteruddannelse i
Bioteknologi
Kursus A
Genomisk DNA
Kursus indhold
Isolering af genomisk DNA
• Dyrk eller indsaml celler/væv
• Riv væv og lyser celler med kemiske,
enzymatiske eller fysiske metoder
• Fjern cellerester
• Fjern resterende proteiner
• Isoler gDNA
• Koncentrer DNA
• Analyser for koncentration og renhed
Åbning af væv og celler
Lysis af celler
• Lysisbuffer:
– Buffer (puffer)
– EDTA
– Detergent
•
•
•
•
SDS
Sarcocyl
Triton X-100
CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromid)
– PVP (polyvinylpyrrolidon)
– Protease
– RNAse
Isolering af DNA
Silica-baseret isolering
Silica
Diatomert jord
Glas
Glasfiberfilter
Chaotropisk salt
Guanidinium hydrochlorid
Guanidinium thiocyanat
Natriumiodid
Natriumperchlorat
Ammoniumsulfat
Vaskeopløsning
KPO4 pH 8.0 + 80% EtOH
Isolering af DNA
• Ionbytning på minikolonne
• Ekstraktion med organisk opløsningsmidler
– Phenol
– Phenol/chloroform
– Chloroform
– Diethylether
Koncentrering af DNA opl.
• Fældning
• pH 4
• Høj [salt]
– NaCl
– KAc
– NaAc
• Ethanol eller isopropanol
• -20°C
Koncentration og renhed
• Koncentration
– Absorbans ved 260nm (OD260 ≈ A260)
– A260 = 1 => [DNA]= 50µg/mL
• Renhed
– A260:A280 = 1,8 => rent DNA
– A260:A280 < 1,8 => DNA forurenet med protein
– A260:A280 > 1,8 => DNA forurenet med RNA
Agarosegelelektroforese
Gennemgang af
forsøgsvejledning
Se i mappen