Transcript Document 7182806

PCR og PCR-RFLP
Udarbejdet af Henning Ilsø,
redigeret og indtalt af Birte Bunch Larsen
Undervisningsplanen for S4-net molekylærbiologi og genetik
Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net
HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen
Grundlæggende om PCR
• PCR efterligner i al sin enkelhed cellernes replikation, der
som bekendt resulterer i en nøjagtig kopiering/fordobling af
cellens arvemateriale.
• Vha. PCR teknikken kan vi i teorien opformere (amplificere)
en hvilken som helst del (op til ca. 40 kb) af en organismes
arvemateriale til millioner af kopier, som vi efterfølgende
kan analysere nøjere for tilstedeværelse af mutationer.
• Metoden er følsom, da den kræver meget lidt DNA.
• Metoden er følsom for kontaminering.
Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net
HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen
Opsætning af PCR-reaktion: reagenser og funktion
En PCR reaktion skal grundlæggende indeholde følgende reagenser:
•
Template DNA: udgangspunkt for PCR; den prøve der skal analyseres.
•
Taq polymerase: thermostabil DNA polymerase fra bakterien Thermus
aquaticus. Tåler opvarmning til 94°C og har temperaturoptimum ved 72°C
•
Buffer: sikrer optimale betingelser for Taq polymerasen.
•
MgCl2: Mg++ er co-faktor for Taq polymerasen.
•
Forward primer: oligonukleotid med en længde på ca. 20 baser.
•
Reverse Primer: oligonukleotid med en længde på ca. 20 baser.
•
dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP): deoxyribonukleotider, dvs. DNA
byggesten.
Når alle reagenser er blandet, sættes reaktionen i en forprogrammeret
PCR-maskine. En typisk PCR-reaktion tager ca. 1,5 time.
Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net
HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen
Mere om
PCR-maskine
PCR reaction og PCR cyklus
• En PCR reaktion kan beskrives som en PCR-cyklus gentaget
ca. 30 gange. I hver PCR-cyklus sker der en fordobling af
det DNA man ønsker at opformere (target). Ved at gentage
denne cyklus 30 gange ender man i teorien op med 230 ≈ 1
milliard kopier af target.
• En
–
–
–
PCR-cyklus består af 3 trin:
Denaturering (trin 1)
Annealing (trin 2)
Extension (trin 3)
Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net
HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen
PCR-cyklus trin 1: denaturering
• Akkurat som det er tilfældet under replikationen, er første trin i
kopieringen af DNA vha. PCR, at DNA dobbeltstrengen gøres
enkeltstrenget (denatureres). I PCR sker dette ved at DNA’et
opvarmes til ca. 94°C, hvorved hydrogenbindingerne i det
dobbeltstrengede DNA brydes og vi får to enkeltstrengede DNA
molekyler:
94°C
Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net
HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen
PCR-cyklus trin 2: Annealing
• Det enkeltstrengede DNA skal nu som ved replikationen fungere
som skabelon (template) for syntese af komplementære DNA
strenge. For at igangsætte synteseprocessen kræves at primere i
dette trin baseparrer (annealer) til template DNA. Vi nedsætter
derfor temperaturen til ca. 60°C (annealings-temperaturen),
hvilket tillader forward- og reverse primer specifikt at anneale til
deres template:
3’
5’
3’
5’
Forward primer
Reverse primer
5’
Mere om
primere
3’
3’
Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net
HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen
5’
PCR-cyklus trin 3: Extension
• Efter at primerne (starterne) har annealet til template, hæves
temperaturen til 72°C, der er temperaturoptimum for den
anvendte thermostabile DNA polymerase. DNA polymerasen
syntetiserer nyt DNA ved at forlænge primerne i 5’3’ retningen.
Med afslutningen af trin 3, er en PCR cyklus tilendebragt, og vi
har en nøjagtig fordobling af det ønskede DNA område (target):
Template
3’
5’
3’
Reverse primer
5’
Target
5’
Forward primer
3’
Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net
HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen
3’
5’
PCR - Resume
Dobbeltstrenget
DNA-template
Varmes op til 94°C
Denaturering af
template ved 94°C
afkøles til 60°C
Annealing af primere
til target ved 60°C
Varmes op til 72°C
Extension af primere
ved 72°C
Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net
HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen
Den skitserede
PCR-cyklus
gentages ca. 30
gange, hvilket
resulterer i millioner
af kopier af target
= PCR-produkt.
PCR-produktet kan
efterfølgende
analyseres for
tilstedeværelse af
mutationer.
PCR - Animationer
Klik på nedenstående links for illustrative PCRanimationer
• PCR-2 (fra Dolan DNA Learning Center)
• PCR-4 (fra MaxAnimations)
Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net
HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen
PCR-RFLP mutationsanalyse
• Når en PCR reaktion er afsluttet kan PCR produktet efterfølgende
analyseres for tilstedeværelse af mutationer. En de anvendte
metoder er RFLP, der er en forkortelse for Restriktions Fragment
Længde Polymorfi (Restriction Fragment Length Polymorphism).
• Forudsætningen for at RFLP kan anvendes i en mutationsanalyse
er at den pågældende mutation resulterer i at et restriktionssite
enten forsvinder eller opstår.
• I PCR-RFLP analyser anvendes restriktionsenzymer (isoleret fra
bakterier), der genkender og klipper specifikke sekvenser
(restriktionssites) i dobbeltstrenget DNA  Restriktionsfragmenter
Mere om
Restriktionensenzymer
Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net
HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen
PCR-RFLP mutationsanalyse
Sekvens genkendes af Eco RI
5’
Normal Allel (N)
3’
GAATTC
CTTAAG
3’
5’
Sekvens genkendes ikke af Eco RI
5’
Muteret Allel (M)
3’
GAACTC
CTTGAG
Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net
HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen
3’
5’
PCR-RFLP mutationsanalyse
Sekvens genkendes af Eco RI
 to restriktionsfragmenter
5’
G
CTTAA
3’
3’
AATTC
G
5’
Sekvens genkendes ikke af Eco RI
 Et fragment
5’
3’
GAACTC
CTTGAG
Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net
HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen
3’
5’
PCR-RFLP visualisering ved gelelektroforese Restriktionsmønstret afslører ens genotype
Homozygot
normal
genotype (NN)
Heterozygot
genotype (NM)
Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net
HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen
Homozygot
muteret
genotype (MM)
Primerne bestemmer
annealingstemperaturen
• Annealingstemperaturen i en PCR fastlægges ud fra primernes
smeltetemperatur (Tm), der afhænger af primerens længde og
basesammensætning. For primere med en længde på 14-25 baser
kan følgende tilnærmede formel benyttes:
Tm ≈ 2x(A+T) + 4x(G+C)
– primer 1: ATTGTATACGTAGTAATCGT Tm = 2x14 + 4x6 = 52°C
– Primer 2: GCTGTCCAGTCCATTGCTGT Tm = 2x9 + 4x11 = 62°C
• For at undgå uspecifik annealing til template og dermed risiko for
uspecifikke produkter er det vigtigt at vælge forward og reverse
primere med Tm værdier tæt på hinanden.
Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net
HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen
PCR-maskine (thermal cycler)
• En PCR reaktion foregår typisk i et 0,2 ml plastic rør eller en
micro-titer plade, som placeres i PCR-maskinens varmeblok. PCRmaskinen er nu i stand til lynhurtigt at veksle varmeblokkens
temperatur mellem de tre niveauer: denaturering  annealing 
extension  denaturering  etc., hvilket er forudsætningen for en
effektiv PCR.
Molekylærbiologi og genetik, F2008, S4 net
HILS/BBLA, VIA University College Bioanalytikeruddannelsen