Transcript No Slide Title

En kræftcelles egenskaber (udvalg):
Normal celle
Kræftcelle
Deler sig ukontrolleret
Er resistent over for
"programmeret celledød"
Kan danne metastaser
Tumordannelse – ophobning af forandringer i cellens gener
Gen-forandringer
Normale celler
Spirende
kræftceller
Fuldmodne
kræftceller
To hovedtyper af cancerrelaterede gener
1. Tumorsuppressor-gener
Gener, der forhindrer en normal celle i at blive til en kræftcelle
- skal inaktiveres for at have en kræftfremkaldende effekt
2. Proto-oncogener
Gener, der kan omdanne en normal celle til en kræftcelle
- skal aktiveres for at have en kræftfremkaldende effekt
Inaktivering af tumorsuppressor-gener
T182I
Mutation
5’
1
2
3
Deletion
5’
1
2
3
2
3
4
5
6
7
3’
6
7
3’
6
7
3’
CH3 CH3 CH3
Metylering
5’
1
4
5
Inaktivering af tumorsuppressor-gener
T182I
Mutation
5’
1
2
3
4
5
6
7
3’
Mutation: Ændring i rækkefølgen af baser i DNA-koden
Normal:
*
-CGG-AAG-ATG-AAG-CCC-TGG-TTG-
DNA
-Arg-Lys-Met-Lys-Pro-Trp-Leu-
Protein
Efter mutation:
*
-CGG-AAG-ATG-AAG-CAC-TGG-TTG-
DNA
-Arg-Lys-Met-Lys-His-Trp-Leu-
Protein
Påvisning af mutationer
1 – Påvisning ved PCR/DGGE
1
2
3
4
5
6
7
8
2 - Identifikation ved sekvensanalyse
9
254
Ile
254
Asn
[
A C G T
A C G T
Mutant
Normal
A
C
T
A
C/T
T/A
A
C
C
A
DNA melting
Abrupt heating
Gradual heating
Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)
Wild-type DNA
Mutant DNA
*
*
Electrophoresis
Increasing denaturant conc.
-
*
*
*
*
+
Heteroduplex analysis
*
*
Mutant DNA
Wild-type DNA
PCR
*
Heteroduplices
*
*
*
Homoduplices
DGGE
Heteroduplices
Homoduplices
CH3 CH3
CH3
CH3
CH3CH3
CH3
CH3 CH3
CH3
CH3
CH3CH3
CH3
DNA
CH3
CH3
ACCCGTCAGATGCGATG
TGGGCAGTCTACGCTAC
CH3
CH3
Maintenance methylation (after DNA replication):
CH3
CH3
ACCCGTCAGATGCGATG
TGGGCAGTCTACGCTAC
CH3
DNMT1
CH3
ACCCGTCAGATGCGATG
TGGGCAGTCTACGCTAC
CH3
CH3
DNA methylation => transcriptional silencing
CpG island
Promoter Exon 1
X
Transcription
Exon 2
Bisulfite modification of DNA
Methylated DNA
CH3
Unmethylated DNA
CH3
5’-CCGACCG-3’
5’-CCGACCG-3’
Sodium bisulfite
CH3
CH3
5’-UCGAUCG-3’
5’-UUGAUUG-3’
PCR
5’-TCGATCG-3’
5’-TTGATTG-3’
Detection of aberrant APC methylation by melting curve analysis
Unmethylated APC
#8
Methylated APC
#7
0.7
0.5
0.6
0.4
0.7
0.4
0.3
0.3
0.2
0.6
0.2
0.1
0.5
0.1
80
82
84
86
88
90
80
Temperature (°C)
0.4
82
84
86
88
90
Temperature (°C)
0.3
#10
0.1
80
82
84
86
88
Temperature (°C)
90
#9
0.7
0.7
0.6
0.6
0.5
0.5
-dF/dT
0.2
-dF/dT
-dF/dT
-dF/dT
-dF/dT
0.5
0.4
0.4
0.3
0.3
0.2
0.2
0.1
0.1
80
82
84
86
88
Temperature (°C)
90
80
82
84
86
88
Temperature (°C)
90
Core histones
Ac
Ac
HD Ac Ac
MBD
Ac
HD
Ac
HD Ac Ac
Ac
MBD
Ac
MBD
Ac
HD
MBD
MBD
Ac
MBD
Ac
HD
Methyl-CpG-binding domain protein
Histone deacetylase
Ac
Ac
Ac
MBD
HD
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
HD
Ac
AcHD
MBD
HD
MBD
MBD
MBD
MBD
HD
Ac
MBD
HD
HD
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Reactivation of gene transcription
Inhibitors of histone deacetylases
(Trichostatin A)
HD
Ac AcHD
MBD
Ac
HD
MBD
MBD
HD
Ac
MBD
MBD
HD
Ac
MBD
HD
Inhibitors of DNA methylation
(5-aza-2’-deoxycytidine)
Reactivation of gene transcription in breast cancer cells (MDA-MB-231)
by inhibition of DNA methylation and/or histone deacetylation
HO
2
ER
MDR1
CacNa1g
GAPDH (control)
Methotrexate (MTX)
 A reduced folate analogue
 Used in the treatment of various malignancies
 Acquired resistance is a major problem in cancer treatment
 Cellular uptake occurs mainly via the reduced folate carrier (RFC)
MTX
MTX
MTX
RFC
MTX
MTX
FPGS
MTX(glu)n
MTX(glu)n
GGH
MTX
Lysosome
FH2
DHFR
TMP
FH4
Purine synthesis (ATP, GTP)
UMP
DNA
Nucleus
MDA-MB-231 breast cancer cells are inherently MTX resistant
MDA-MB-231
100
Cell num ber (% of control)
Cell num ber (% of control)
Transfection of MDA-MB-231 cells with RFC
MCF-7
80
60
40
20
0
0.001
0.01
0.1
1
MTX concentration (µM)
10
100
vector
100
RFC.3
RFC.5
80
RFC-EGFP.1
RFC-EGFP.2
60
40
20
0
0.001
0.01
0.1
1
MTX concentration (µM)
10
100
Worm et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:39990
RFC promoter methylation in MDA-MB-231 cells
Methylation-specific PCR
U
M
Worm et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:39990
Reactivation of RFC expression by 5-aza-2’-deoxycytidine
R
R
Cd
Cd
a
a
Az
Az
dR
dR
dR
5
5
C
C
C
aaaM
M
z
z
z
µ
µ
A
A
A
2
5
5550.
0.
+
+
µM
µM
µM
A
A
A
1
2
5
0.
0.
0.
TS
TS
TS
M
MCF-7
MDA-MB-231
H2O
300 bp
200 bp
600 bp
500 bp
RFC
GAPDH
Worm et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:39990
Cell number (% of control)
5-Aza-2’-deoxycytidine + dipyridamole increases
MTX sensitivity in MDA-MB-231 cells
100
Control
DPM
80
5-aza-CdR
60
5-aza-CdR + DPM
40
20
0
0.01
0.1
1
10
100
MTX concentration (µM)
Worm et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:39990
En kræftcelles egenskaber (udvalg):
Normal celle
Kræftcelle
Deler sig ukontrolleret
Er resistent over for
"programmeret celledød"
Kan danne metastaser
En kræftcelles egenskaber (udvalg):
Normal celle
Kræftcelle
Deler sig ukontrolleret
Skematisk fremstilling af celledelingscycklus
En celle i deling
Checkpoint:
Kontrolpunkt, hvor celledeling stopper, og DNA-skader
repareres, inden delingen går videre
Checkpoints kontrolleres af proteiner –
oncogener og tumorsuppressorer
Nogle aktører i kontrol af cellecyklus (G1)
Normalt DNA: Proteinet varetager sin funktion
og holder cellens deling i skak
Muteret DNA: Proteinet er defekt,
og cellens deling løber løbsk
Forskellige gen-forandringer kan have samme effekt
Genetiske forandringer i p16-Rb-Cdk4-signalvejen i
modermærkekræft
p16
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
Rb
Cdk4
p53 – DNA’ets vogter
p53
Ved begrænset DNA-skade stopper p53 cellecyklus
Ved begrænset DNA-skade stopper p53 cellecyklus
Ved omfattende DNA-skade inducerer p53 celledød
Ved omfattende DNA-skade inducerer p53 celledød
Lymfekræft: Sammenhæng mellem
overlevelse og mutationer i p16 og p53
Overlevelse
1
Ingen mutationer
,8
Mutationer i enten
p16 eller p53
,6
,4
Mutationer i både
p16 og p53
,2
0
0
20
40
60
80
100
Måneder
120
140
160
Nedarvning af modermærkekræft
Nedarvning af modermærkekræft