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Desnaturalización de proteína
Cu-Zn SOD sometida a
diferentes concentraciones de
SDS. 1H RMN, en a sin SDS y
en b con 5% de SDS. Los
espectros muestran las regiones
de protones aromáticos y de
amida (6.5 - 9 ppm), y de
protones de carbono alfa y
metínicos (< 5.8 ppm).
Int. J. Biol Macromol (2001) 29;
99-105
1
Unión de ligando a proteína
1H
RMN de insulina. Región de los protones
de residuos aromáticos con diferentes
concentraciones de ion cinc agregado. Los
números indican las veces en exceso que se
encuentra el Zn2+.
2
Unión de ligando a proteína
Zhuang, Z, et al (2002)
Biochemistry, 41, 1115211160
NMR de 4-HidroxibenzoilCoA tioesterasa
3
Propiedades de aminoácidos en proteínas
1H
RMN de la proteína
nucleocápside HIV-1
(Bombarda, E. et al (2001)
J Mol Biol 310, 659).
Los diferentes puntos
representan los protones
del Cb de la Cys36 (▲),
Cys39 (● y ♦) y Cys49 (■)
4
Determinación de pH intracelular
pKa = 6.8
H2PO4-
HPO42- + H+
5
buffer
Metabolismo de glucosa
en E. coli
Glucosa 13C-1 50 mM a t = 0
FDP =
L=
A=
E=
S=
B=
fructosa 1,6-bisfosfato
lactato
acetato
etanol
succinato
buffer
6
Cinética enzimática en mitocondrias intactas
Creatina + ATP
creatina fosfocinasa
fosfocreatina + ADP
Creatina + ADP
creatina fosfocinasa
fosfocreatina + AMP
fosfato inorgánico (1), fosfocreatina (2), fosfatos g, a y b (3-5) del ATP y fosfatos b y a del ADP (6-7).
7
Calbindina
PNAS, 92: 4748
8
Obtención de estructuras de proteínas por
RMN
Requisitos
[Proteína] ~ 1 mM
0.5 mL
estable por al menos 24 h a
temperatura ambiente
monomérica
tc < 10 ns
secuencia de aminoácidos
Masa molecular...
a confirmar
9
Distribución de
pesos moleculares de
proteínas resueltas
hasta 1997
10
Distribución de pesos moleculares
de proteínas resueltas hasta 2010
1400
152 kDa a abril de 2010
PDB ID: 2P80
1200
Núm. de estructuras
1000
800
600
400
200
0
20
40
Masa molecular (kDa)
140
11
El inicio de la
historia
Ribonucleasa
a 40 mHz
JACS (1957) 79:3289
12
Ribonucleasa
a 56.4 mHz
JBC (1962) 237:1807
13
Ribonucleasa
a 60 mHz
Science (1967) 157:257
14
Espectros de
1H RMN de:
nucleasa de
estafilococo
(156 aminoácidos)
Inhibidor pancreático
básico de tripsina
(58 aminoácidos)
Magainina 2
(23 aminoácidos)
15
Lisozima
16
17
Asignación de
resonancias para
grupos laterales
18
Magainina 2 con
asignación de
señales para una
valina
19
Acoplamiento entre
protones de amida y
protones de Ca
20
Ec. de Karplus
J() = Acos2() - Bcos() + C
3
JHa,HN() = 6.4cos2(-60º) - 1.4cos(-60º) + 1.9
H
R
C
H
O
N φ
C
R
C
C 
C
R
O
N
H
H
i
hélice a ( = -57º),
hélice 310 ( = -60º),
hoja b antiparalela ( = -139º),
hoja b paralela ( = -119º),
H
Medida de
acoplamientos y
estructura secundaria
i+1
3
JHa,HN
JHa,HN
3
JHa,HN
3
JHa,HN
3
=
=
=
=
3.9
4.2
8.9
9.7
Hz
Hz
Hz
Hz
21
Efecto nuclear Overhauser
Los núcleos intercambian constantemente su
magnetización a velocidades que dependen de la
sexta potencia de su distancia. Si se miden las
velocidades del intercambio de magnetización se
obtiene un conjunto de distancias internucleares.
Este intercambio de magnetización se conoce como
efecto nuclear Overhauser (NOE).
22
Correlación a través del espacio
23
Correlación a
través del espacio
24
NOESY
región NN
Hélice a entre
los residuos
89 y 101
25
Contactos lejanos y estructura terciaria
sin asignación de secuencia
con asignación de secuencia
26
El resultado…
Lisozima (1E8L)
27
Los resultados…
Lisozima (1E8L)
28
Bibliografía
29