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Resonancia magnética nuclear
1. ¿Qué es y para qué sirve? 3. Aplicaciones de RMN en
Instrumentación
bioquímica
•
Cinética y vías metabólicas
2. Parámetros de un
espectro sencillo de RMN • Unión de ligandos a
•
•
•
•
•
Intensidad (área bajo la curva)
Desplazamiento químico (d).
Grupos funcionales en 1H
RMN
Desdoblamiento de señales
Tiempos de relajación
Espectros bidimensionales
•
•
macromoléculas
Modificaciones estructurales
de proteínas
Determinación de estructuras
de macromoléculas.
1
Los núcleos atómicos se comportan como
pequeños imanes
sin campo
con campo
2
En presencia de un campo magnético
se separan dos estados energéticos
h
E  h   N
B
2
campo magnético
3
Propiedades de algunos núcleos atómicos
Abundancia
Isótopo natural
(%)
número
cuántico
de spin (I)
1H
99.984
1/2
2.79628
300.13
1.0000
2H
0.016
1
0.85739
46.07
0.0964
1/2
0.70220
75.47
0.0159
1
0.40358
21.68
0.00101
−0.28304
30.41
0.00104
5/2
−1.8930
40.69
0.0291
1/2
2.6273
282.40
0.834
1.1205
121.49
0.0664
12C
98.9
13C
1.1
14N
99.64
15N
0.37
16O
99.76
17º
19F
28Si
31P
0.0317
100
92.28
100
Frecuencia de
Momento
Sensibilidad
resonancia a
magnético (μ)
relativa
7 T (MHz)
0
1/2
0
0
1/2
4
Equipo básico de RMN
transmisor de
radiofrecuencia
receptor de
radiofrecuencia
Bobinas
de barrido
Bobinas
de barrido
Polo del
imán
Polo del
imán
Control y
registrador
Tubo de
muestra
Generador
de barrido
5
Parámetros de un espectro de RMN
1) Intensidad (área bajo la curva). Es proporcional al número
de protones que dan origen a la señal
6
Parámetros de un espectro de RMN
2) Desplazamiento químico (d)

B
d
ref
 Bmuestra 
Bref
 10
6
Es producto del campo magnético inducido por los
electrones vecinos al núcleo
7
Parámetros de un espectro de RMN
2) Desplazamiento químico (d)
desprotegido
protegido
campo bajo
campo alto
8
Parámetros de un espectro de RMN
2) Desplazamiento químico (d)
9
Parámetros de un espectro de RMN
2) Desplazamiento químico (d)
Observaciones:
• Los grupos electronegativos “desprotegen” a los núcleos y tienden
a desplazar las señales a “campo bajo” (a mayores valores en ppm)
• Los protones unidos a O y N tienen desplazamientos químicos
muy variables que son sensibles a la concentración (formación de
puentes de hidrógeno) a la temperatura y al disolvente (fenómenos
de intercambio químico).
• Los sistemas  desprotegen mucho a los protones que tienen
unidos y tienden a desplazar las señales a “campo bajo” (a
mayores valores en ppm)
10
Parámetros de un espectro de RMN
3) Desdoblamiento de señales (acoplamiento spin-spin)
núm. de
vecinos
1
2
3
11
Parámetros de un espectro de RMN
3) Desdoblamiento de señales (acoplamiento spin-spin)
Sin hidrógenos
acoplados
Un hidrógeno
acoplado
Dos hidrógenos
acoplados
Tres hidrógenos
acoplados
singulete
doblete
doblete
triplete
cuarteto
triplete
cuarteto
Triángulo de Pascal
12
Parámetros de un espectro de RMN
4) Tiempos de relajación
El término relajación describe varios procesos por los cuales la
magnetización de un estado fuera del equilibrio regresa a la distribución
de equilibrio. Es decir, la relajación describe qué tan rápido los spines
nucleares “olvidan” la dirección en que estaban orientados. Las
velocidades de esta relajación de spines se puede medir y tiene
aplicación en espectroscopía y en obtención de imágenes.
13
Interpretación de espectros simples de 1H
RMN
Qué se puede obtener del espectro:
1- ¿Cuántos tipos de H hay? – Indicado por cuántos
grupos de señales hay en el espectro
2.- ¿Qué tipos de H ? – Indicados por los desplazamientos
químicos de cada grupo
3.- ¿Cuántos H hay de cada tipo? – Indicados por la
integración de la señal de cada grupo
4.- ¿Cuál es la conectividad? – A través de los patrones de
acoplamiento sabemos qué grupo es vecino de qué grupo.
14
Algunos ejemplos de espectros e
interpretación
15
http://ajax.prenhall.com/~bookbind/books/hanson/book/chapter16/medialib/flash/page3.htm
16
Algunos ejemplos de espectros e
interpretación
17
H
Molécula con un
alqueno terminal
HO
HO
CH3
H
H
HO
HO
H
H HO
CH3
H
H
H
H HO
HO
H
H
Molécula con un patrón
de desdoblamiento de 9
líneas
Me
OH
H
OH
Nueve líneas, las de los
extremos son demasiado
pequeñas y no se ven
Me
Me
Me
OH
Me
H
Me
OH
H
Me
Me
OH
18
Un poco más complicado: 2D
C4H8O: COSY
CH3 – CH2 – CH2 – OH
CH2 OH
CH2 CH3
19
Unión de ligando a ADN
Robinson, H. and A. H. Wang
(1996). Nucleic Acids Res
24(4): 676-82. Usan 1H RMN
para estudiar las transiciones
estructurales en el
polinucleótido dúplex
A2G15C15T2 en presencia de
la sonda catiónicas Co(NH3)63+.
Las figuras muestran dos
secciones del espectro donde se
ven algunos de los protones de
las bases en presencia de
Co(NH3)63+ en diferentes
relaciones de concentración
respecto al ADN.
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Unión de ligando a proteína
19F
RMN de una proteína intestinal
de unión a ácidos grasos. La
proteína se preparó con ocho
residuos de 4-19F-fenilalanina, los
números de residuo son los que
aparecen arriba de los picos en los
espectros. El espectro de arriba
(holo) corresponde a la proteína
unida a una molécula de ácido
oleico, mientras que el espectro de
abajo (apo) es el de la proteína sin
ligandos.
21
Modificación de proteínas
(A) Lisozima intercambiada con deuterio
(B) Lisozima sin intercambio (1H)
(C) Lisozima precipitada en D2O con un
desnaturalizante suave
22
Chang, S.T. et al (1998) Biotech. and Bioeng. 59:144.
Modificación de proteínas
(A) Lisozima intercambiada con deuterio
(B) Lisozima sin intercambio (1H)
(C) Lisozima precipitada en D2O con un
desnaturalizante suave
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Chang, S.T. et al (1998) Biotech. and Bioeng. 59:144.
Desnaturalización de proteína
Cu-Zn SOD sometida a
diferentes concentraciones de
SDS. 1H RMN, en a sin SDS y
en b con 5% de SDS. Los
espectros muestran las regiones
de protones aromáticos y de
amida (6.5 - 9 ppm), y de
protones de carbono alfa y
metínicos (< 5.8 ppm).
Int. J. Biol Macromol (2001) 29;
99-105
24
Unión de ligando a proteína
1H
RMN de insulina. Región de los protones
de residuos aromáticos con diferentes
concentraciones de ion cinc agregado. Los
números indican las veces en exceso que se
encuentra el Zn2+.
25
Unión de ligando a proteína
Zhuang, Z, et al (2002)
Biochemistry, 41, 1115211160
NMR de 4-HidroxibenzoilCoA tioesterasa
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Propiedades de aminoácidos en proteínas
1H
RMN de la proteína
nucleocápside HIV-1
(Bombarda, E. et al (2001)
J Mol Biol 310, 659).
Los diferentes puntos
representan los protones
del Cb de la Cys36 (▲),
Cys39 (● y ♦) y Cys49 (■)
27
Cinética enzimática
t= 
t=30 min
t=10 min
t=0 min
31P
RMN ( J. Biol. Chem.
(1996) 45; 28038-44).
Mezcla de reacción que
contiene inicialmente ATP,
GMP y guanilato quinasa
(GK) (espectros a, b, c, d)
o bien ADP, GDP y GK
(espectros e, f, g, h) y cuyo
cambio se observa en el
tiempo.
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