Transcript 藥材成分預試驗
藥材成分預試驗 預試驗 • 預試驗是應用少量樣品和簡單快速的操作。 找出藥材中所含成分，為進一步的分析提 取工作提供途徑。 • 預試驗是初步判斷藥材成分的分析操作。 • 預試驗的結果也可作為研究藥材加工、炮 製和貯藏條件時的參考。 預試驗方法 一、檢查藥材的性狀、顏色、氣味及炮製 二、前處理 三、預試驗 四、微量昇華試驗 五、分光分析 六、螢光反應 預試驗方法 一、仔細檢查藥材的性狀、顏色及氣味(小心 毒品)，並考慮加工條件 利用手切片，藉由顯微鏡檢查。可在顯微 鏡下觀察澱粉粒、黏液質、油脂的有無等。 ＊澱粉粒有一定的形狀，遇碘液顯藍色。 ＊黏液質多在黏液細胞中，常伴有草酸鈣針晶束。 ＊油脂易為蘇丹紅染色，且不溶於水和氯乙醛液中。 預試驗方法 二、前處理 取樣品5~10g，加水約50~100ml，在水浴上 於40~60℃加熱約10~15分鐘，過濾，取濾 液分別進行預試驗。 預試驗方法-1 三、預試驗 1.觀察濾液的顏色、狀態、氣味及有無析 出物(蛋白質及碳水化合物加醇而析出沉 澱）。 2.酸度試驗：如呈酸性反應。表示可能有 游離酸、酸性鹽類及酚類衍生物的存 在。 預試驗方法 3.微量化學法(Microchemistry method) 極少量之檢體或生藥組織內含物加上某些 特定試藥可能產生某些反應，如呈色、沉 澱、結晶或溶解等可以在顯微鏡底下觀察 並加以確認，稱為微量化學。 ＊含昇華性物質的生藥，微量昇華所得昇 華物之晶體，融點測定、試藥之呈色反應 及沉澱反應等，也是微量化學的一部份。 微量化學法 • 滴加試藥於載玻片上之生藥檢體，或檢體 以試液浸漬後置於載玻片上，然後鏡檢細 胞內容物之呈色及結晶析出之有無。 微量化學法 1.氯化鐵試驗：若顯綠色、藍色至棕色表示 可能有酚基性物質如鞣質及色素的存在。 Tannin之生藥，如丁香(Eugenol)、甘茶 (phyllodulcin)、黃芩(Wogonin)、牡丹皮 (Paeonol)、芍藥、知母、牻牛兒苗等，可以 所含phenol類tannin類成分與FeCl3呈現不同 色調。 Eugenol Tannin •鞣質廣泛存在植物界，幾乎所有科的植 物都有鞣質成分存在；當鞣質過多時，他 們可能在植物的葉、根、幹、樹皮及果實 中。 •鞣質屬於複雜的物質，通常以多酚的形 式存在，由於不易結晶，難以純化。 Tannin •鞣質通常不會結晶，與水形成酸性反應 的膠體溶液。 •鞣質可沈澱明膠和生物鹼；與鐵鹽形成 深藍色或墨綠色可溶性物質；與 K3Fe(CN)6和NH3產生深紅色反應。 •鞣質與重金屬銅、鉛、錫的鹽類，重鉻 酸鉀溶液或1﹪鉻酸生成沈澱物；在鹼性 溶液中，鞣質會吸收氧而氧化變黑。 氯化鐵試驗 ＊Tannin加FeCl3 呈污綠色，加1% K2Cr2O7 呈黃紅色、加甲烯藍(methylene blue)可染 色。 ＊鞣質可與蛋白質、明膠、生物、鹽等溶液 發生沉澱。酚基性質可因分子組成中，基的 多少及其位置不同與鐵鹽產生各種顏色。如 青、綠、藍、紫色等。 微量化學法 2.重金屬鹽試驗：加入醋酸鉛溶液如發生 沉澱，則可能有蛋白質、鞣質、酸類等。 ＊過濾或用離心機分離後，加鹼式醋酸鉛於 濾液中，如有沉澱，則可能有黏液質、樹 膠或皂素等物質。 微量化學法 3.斐林試驗：凡有糖的一般反應(溶液加α-奈酚醇 液數滴混和後，遇濃硫酸產生色環)，可進行此試 驗。 ＊加入同容量的斐林氏溶液甲、乙新鮮混合液，加 熱至微沸，如有還原性物質存在，則產生磗紅色氧 化亞銅沉澱。此還原性物質可能是單糖。 ＊ CuSO4可以用來測試醛類、還原糖(雙醣皆可,蔗糖 除外),醛醣(葡萄糖是醛醣)反應後 CuSO4的銅離 子由 2價變成 1價，產生紅色氧化亞銅 Cu2O 。 斐林試驗 ＊先加鹽酸少許煮沸(水解)。再加鹼中和，然後加 斐林氏溶液操作如(1)法。如果(1)試驗結果無氧化 亞銅沉澱而現在產生沉澱；或本試驗的沉澱量較(1) 增加，表示可能有醣類、蔗糖或其他雙糖，可溶的 多糖物存在(醣類水解時可見絮狀沉澱物質)。 • 菊糖(Inulin)：加酒精浸漬數日後有球晶析出。 4.泡沫發生試驗 將溶液強烈振盪。如有持久性泡沫發生，則 可能有黏液質、蛋白質、皂素存在。 皂素(Saponin) •植物的二次代謝產物，於植物界分布很 廣，每種植物所含的皂素結構會有差異。 •依其水解後結構可將皂素分為二種，甾 體皂素(Sterol saponin)與三萜類皂素 (triterpene saponin)。甾體皂素一般由 27 個碳鏈組成，而三萜類皂素一般由30 個碳鏈組成。 皂素(Saponin) •皂素有強烈溶血性(hemolysis)，能破壞 紅血球，可經由口服的方式降低毒性。 •而皂素有許多生理功能，例如人蔘總皂 苷(TSPG)可以使免疫球蛋白IgG的含量上 升及當作抗氧化劑，桔梗皂素(SPR)可以 抑制癌細胞生長，藜屬皂素可以改變膜的 通透性、降低膽固醇、抑制黴菌生長、增 進藥劑黏膜吸收、生物殺蟲劑等功效。 泡沫發生試驗 •含有saponin之生藥如遠志、柴胡、桔梗、 竹節人參、知母、木通等，其粉末加水激 烈振盪後會產生持續性蜂窩狀泡沫。 ※黏液質、蛋白質遇醇沉澱；蛋白質遇熱 能凝結為絮狀沉澱；皂泡沫持久性最大， 遇熱及醇不變化，且有溶血反應。 Liebermann-Burchard反應及 Salkowski反應 • 含植物色素成分Flavonoid, Xanthone, Quinone, Carotenoid等可以濃硫酸呈色或含Triterpenoid, Steroid類生藥經濃硫酸處理後亦會呈色。 • 一般以Acetic Anhydride為溶劑時稱為 Liebermann-Burchard Reaction，以Chloroform為 稱溶劑時稱為Salkowski Reaction。 • 前者反應時，濃硫酸和溶劑分層。由接觸面以及 上層之色調可區別，屬Triterpenoid者，接觸面為 赤~紫色，如桔梗、人參、茯苓、連翹、桑白皮、 茅根、豬苓等可以此法確認；而屬於Steroid者， 接觸面(Acetic Anhydride Layer)呈青~綠色，如山 藥、知母等以此法呈色。 Liebermann-Burchard反應及 Salkowski反應 • Salkowski反應時，振盪混合後。 Chloroform層呈赤色，硫酸層則呈綠色螢 光，此種反應可用於蟾酥，laonlin之確認。 • 薄荷、紫蘇葉之類含Terpere類，加上無 水醋酸再由硫酸使其呈色。 類萜苹Terpenoid • 類萜苹在自然界分佈很廣泛的化合物，尤 其是高等植物，此外，黴菌、海洋生物、 昆蟲的費洛蒙與防禦物質都有存在。 • 目前自然界所單離出萜苹類化合物，總數 超過20000個，遠超過任何天然物族群， 植物萜苹類化合物可說是支配主要的化學 生態學。 類萜苹Terpenoid • 萜苹類的功能有:植物防衛素、昆蟲厭食 症、授粉吸引劑、草食動物的防衛性物質、 費洛蒙、植物生長抑制化合物、植物賀爾 蒙與訊號分子。 6.鎂帶反應 • 含Flavonoid生藥如陳皮、橙皮、連翹、 枳實、蕺菜等在Ethanol溶液中，與Mg及 HCl作用會呈紅色反應，其中含Flavone, Flavanone, Flavonol, Flavanonol 又其Glycoside者均有呈色反應而含Chalcone, Isoflavone 者不呈此反應色。 7.生物鹼(Alkaloid)沉澱反應 • 取樣品1~5g。加1%鹽酸或醋酸10~50ml。加溫浸 漬約15分鐘，取濾液，以沉澱劑(Mayer, Dragendroff)或呈色劑(Erdmann, Frode)檢測試之， 如用三種試劑均為陰性反應，則證明無生物存在； 如為陽性反應則表示可能有生物存在。 生物鹼(Alkaloid)沉澱反應 • • • • • • • • • (1) Dragendorff Reagent Method (2) Meyer Test Solution Method (3) I2 Test Solution Method (4) P-Dimethylaminobenzaldehyde Test Solution Method (5) Vitali Reaction (6) H2SO4及Cl2反應 (7) Thalleioquine Reaction (8) Marquis Reaction (9) Copper sulfate Test Solution及 Sodium hydroxide T.S.反應 (1)Dragendorff Reagent Method Dragendorff Reagent之製備： A Solution: Bismuth subnitrate 0.85g+glacial acetic acid 10 ml溶解後加水40ml B Solution: Potassium iodide 8g+20 ml H2O 溶解 之。 使用前A液、B液及冰醋酸等量混合。 噴霧用Dragendorff Reagent之製備：A Solution 4ml + B Solution混合，加dil. Acetic acid 使至20ml，使 用前才調製。 (1)Dragendorff Reagent Method • 生藥如檳榔，川骨可加Dragendorff Reagent起沈 澱反應。 • 顛茄根、東莨菪抽出成分atropine, scopolamine， 同時以TLC展開後，噴上Dragendorff Reagent後， 比較其黃赤色Spot之Rf值。 • Dragendorff 試藥（碘化鉍，碘化鉀，鹽酸）： 與生物鹼生成紅棕色沈澱。 (2)Meyer Test Solution Method • 生藥厚朴、吳茱萸、防己、苦參、延胡索等可以 Meyer T.S.作確認試驗。 • Meyer試劑（碘化汞鉀）：與生物鹼生成淡黃色 沈澱。 (3)I2 Test Solution Method • 生藥厚朴、防己可以此法確認 • Wagner試劑（碘、碘化鉀）：與生物鹼 生成棕色沈澱。 (4)P-Dimethylaminobenzaldehyde Test Solution Method •含Indole之生藥如吳茱萸、蟾酥、麥角 與p-dimethylaminobenzaldehyde T.S.可呈 顯著呈色反應。 含有Indole生物鹼 ＊Indole生物鹼在藥學上佔有重要地位 • • • • • • • 麥角新鹼（ergonovine) 麥角胺鹼 (ergotamine) 毒扁豆鹼（physostigmine) 蛇根鹼 (reserpine) 長春花鹼 (vinblastine) 番木鼈鹼 (strychnine) 育亨賓 (yohimbine) (5) Vitali Reaction • 生藥顛茄根及東莨菪根含有Hyoscyamine, atropine, scopolamine等tropane alkaloid， 以硝酸處理後，殘留物加 dimethylformamide( DMF,二甲基甲醯胺) 溶解，加tetraethylammonium hydroxide （四乙基氫氧化胺）則呈赤紫色。 (6)H2SO4及Cl2反應 • 生藥含berberine系alkaloid者，其水浸液徐 之加入硫酸，冷卻後緩緩加入Cl2 T.S. 接 觸面呈淡赤色~赤色。 (7) Thalleioquine Reaction • 金維納樹皮含quinoline、quinidine等 alkaloid，其水溶液加Br2及NH4OH 呈綠 色。 (8) Marquis Reaction • 鴉片所含alkaloid加Formalin-H2SO4先呈赤 紫色，之後轉為紫色。 • codeine為藍色；morphine為桃紅色 (9)Copper sulfate Test Solution及 Sodium hydroxide T.S.反應 • • • 麻黃之溶液加Cu(SO4)2, NaOH 及ether混 和，ether層呈赤紫色，此法可檢測 ephedrine。 麥角、馬錢子 、印度蛇木、黃連、黃蘗： 加HNO3，呈紫紅色等。 植物某些物質如蛋白質、個別可能和生 物沉澱劑發生作用。切片應浸漬於酒精 溶液(1:20)數小時，以為比較對照。 8. Hydroxyanthraquinone • 加KOH、NaOH、NH4OH呈紅色。 • 蘆薈浸膏因本身係紅棕色，故不適於本反 應之確認。 9.脂肪、脂肪油、揮發油以及樹油 • 加有機溶媒為可溶、加Alkaline水 溶液呈紅色、加Sudan III Solution則現橙紅色。 10.色素類 Carotene Xanthophyll • 加Methanol-KOH Solution呈針狀結 晶。 11.Enzyme加水分解 • 桃仁、杏仁加水打碎後，生藥內含 有之Emulsin將Amygdalin水解，產 生Benzaldehyde可嗅知。 12.Iodine Test Solution、 Bromine Test Solution反應 • 可用於含澱粉及多糖類生藥之確認 • 多糖類之立體構造與I2 Test Solution呈特 異色調，如茯苓呈濃赤褐色，人參呈暗青 色，山藥呈青色，薏苡仁呈暗赤褐色。 • 蘆薈的水浸液加入Br2 Test Solution，會有 Aloin溴化物之淡黃色沉澱物析出。 13.鈣鹽、磷酸鹽等無機離子之檢出 •牡蠣、龍骨等鈣鹽可由定性而確認，龍 骨則可以Ammonium Molybdate Test Solution產生黃色沉澱，確認其所含之磷 酸鹽。 14.alkali之反應 • 龍膽、紫草、大黃、番瀉葉類含 benzoquinone、naphthoquinone、 anthraquinone等quinone及Xanthone類成分 者，其抽出液加入alkali後可觀察其顏色 變化。 • 紫草含acetylshikonin(屬naphthoquinone)。 紅色之Ethanol solution中加入NaOH 後呈 青紫色。 • 油脂類生藥由Caustic alkali加水分解，產 生脂肪酸及Glycerin，由生成之脂肪酸類 可區別生藥，如花生油-Arachic Acid、菎 麻油-Sebacic Acid。 四、微量昇華試驗 植物成分，在固態加熱時可在未達 熔點前，即揮發而昇華。普通微量昇法 所得的結晶體大多混有植物因遇熱破壞 而產生物質等。如果應用真空昇華法。 則所得結果較佳。 四、微量昇華試驗 微量昇華結晶物可在顯微鏡下觀察其形狀 及顏色，並檢查此結晶物在水、酸鹼溶液 及各種有機溶劑中的溶解度。有時加濃硫 酸、濃硝酸等，可顯出顏色反應。 • 芍藥的benzoic acid，安息香的cinnamic acid，熊果葉之hydroquinone之針狀結晶 等。 五、分光分析 化合物在紫外線及紅外線光譜各有特別吸 收，且大都可以試藥移動可視部之吸收波 長。 如山梔子與一定量之水加溫，所得抽出 液之色調以標準重鉻酸水溶液比較而予確 認。 六、螢光反應 生藥常含有會發出螢光成分可供作確認及 純度檢查，如含Coumarin之白芷，其 Ethanol Extract以主波365nm之紫外線照 射時呈青~青紫色，東莨菪之CHCl3 Solution 加Ammonia Test Solution後呈青綠色螢光。 大黃以365nm紫外線照射時，若呈現 rhaponticin之青紫色者，為品質低劣品， 可供純度鑑定。