Transcript Kalibracja uniwersalna

Chromatografia
dr inż. Andrzej Radomski
CHROMA (gr. barwa)  CHROMATOGRAFIA
1906 – M. Cwiet (rosyjski botanik – Warszawa)
Rozdzielenie mieszaniny barwników w ekstrakcie
roślinnym na kolumnie z węglanem wapnia (kredą)
– chromatografia kolumnowa (cieczowa) – LC
Martin i Synge (1941) – chromatografia bibułowa –
Nobel! – PC
James i Martin (1952) – chromatografia gazowa – GC
Stahl (1956) – chromatografia cienkowarstwowa – TLC
koniec lat 60-ych – wysokosprawna chromatografia
cieczowa – HPLC
początek lat 80-ych – chromatografia wykluczania
przestrzennego – SEC
Przegląd technik chromatograficznych
 cieczowa – LC (liquid chromatography)
 bibułowa – PC (paper chromatography)
 odwrócony układ faz
 cienkowarstwowa – TLC (thin layer chromatography)
 normalny układ faz (adsorpcyjna)
 odwrócony układ faz (podziałowa)
 wysokociśnieniowa – HP-TLC (high perssure...)
 gazowa – GC (gas chromatography)
 adsorpcyjna (gaz-ciało stałe)
 podziałowa (gaz-ciecz, GLC)
 wysokosprawna cieczowa – HPLC (high performance liquid chromatography)
 normalny układ faz (adsorpcyjna i podziałowa)
 odwrócony układ faz (podziałowa)
 jonowymienna
 wykluczania przestrzennego, żelowa – SEC, GPC
(size exclusion chromatography, gel permeation chromatography)
 fluidalna – SFC
Mechanizm rozdziału chromatograficznego
Współczynnik podziału
K
Cfaza ruc hom a
Cfaza stacjonarna
Model układu chromatograficznego
złożony jest z szeregu półek, na których
osiągany jest stan równowagi. Transport
substancji wzdłuż układu odbywa się w
fazie ruchomej.
Przykład dla K =1.
160
0
80
80
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
80
40
40
80
0
40
40
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
40
20
20
40
40
40
40
40
0
20
20
0
0
0
0
0
0
0
0
0
20
10
10
20
40
30
30
40
20
30
30
20
0
10
10
0
0
0
0
0
10
5
5
10
30
20
20
30
30
30
30
30
10
20
20
10
0
5
5
Mechanizm rozdziału chromatograficznego
99
92
85
78
71
64
półka
99
92
85
78
krok 5
krok 20
krok 50
krok 100
71
64
57
43
36
29
22
8
15
1
99
92
85
78
71
50
K=10
krok 5
krok 20
krok 50
krok 100
64
57
50
43
36
29
22
8
15
1
krok 5
krok 20
krok 50
krok 100
półka
K=2
półka
50
43
36
29
22
8
15
1
99
92
85
78
71
półka
57
K=4
krok 5
krok 20
krok 50
krok 100
64
57
50
43
36
29
22
8
15
1
K=1
Zależność sprawności kolumny od prędkości
przepływu fazy ruchomej
B
H  A   Cv
v
spr awność kolumny
wysokość półki teor etycznej
niejednorodne procesy przepływu (dyfuzja wirowa)
dyfuzja osiowa
(większe znaczenie w chromatografii gazowej)
brak równowagi w wyniku oporów przenoszenia masy
(powolna dyfuzja w ziarnach, może być też
adsorpcja – desorpcja na powierzchni)
0
1
2
3
prędkość przepływu, ml/min.
4
Analiza ilościowa – metody
Normalizacji wewnętrznej
- porównanie pól pików, suma = 100%
- dobre wyniki tylko w nielicznych
przypadkach, np. analiza frakcji benzyny,
nafty
Normalizacji korygowanej
- jw., ale pola mnożone przez
współczynniki zależne od reakcji
detektora
- poprawne wyniki tylko w przypadku
obecności wszystkich substancji na
chromatogramie; może być
wykorzystana do analiz porównawczych
I
II
III
IV
V
powierzchnia piku
75.0
66.0
77.0
188.0
126.5
 532.5
stężenie substancji
14.1%
12.4%
14.5%
35.3%
23.8%
 100%
I
II
III
IV
V
współczynnik czułości detektora
1
0.2
1.3
1.8
0.9
skorygowana powierzchnia piku
75.0
330.0
59.2
104.4
140.6
 709.2
stężenie substancji
10.6%
46.5%
8.4%
14.7%
19.8%
 100%
Analiza ilościowa – metody
C = 15 mM
C = 10 mM
C = 6 mM
C = 3 mM
C = 1 mM
stężenie
15
Kalibracji bezwzględnej
(wzorca zewnętrznego)
10
5
0
0
20
40
60
powierzchnia piku
80
- na podstawie roztworów wzorcowych
wykonywana jest krzywa kalibracyjna
zależności pola piku od ilości oznaczanej
substancji
- szybka i poprawna pod warunkiem
stosowania aparatu dobrej jakości
oraz powtarzalnego dozowania
Analiza ilościowa – metody
C = 15 mM
C = 10 mM
C = 6 mM
C = 3 mM
C = 1 mM
stężenie
15
Wzorca wewnętrznego
10
5
0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
stosunek powierzchni pików:
substancja badana / wzorzec
2.5
- krzywa kalibracyjna opisuje zależność
między ilością oznaczanej substancji a
stosunkiem pól pików substancji i
wprowadzonego do próbki wzorca
- dłuższa niż poprzednia, ale daje poprawne
wyniki niezależnie od wielkości
zadozowanej próbki
Schemat chromatografii gazowej
N2, He, Ar, H2
Komora dozowania - inżektor
Fazy stacjonarne w chromatografii gazowej
O
100% methylsilicon
poly(dimethylsiloxane)
phenyl
CH3
O
O
vinyl
Si
O
CH3
O
O
CH3
O
CH3
Si
Si
Si
Si
Si
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
N-2-methylpropionyl-L-valin-t-butylamid
trifluoropropyl
Si
Si
F
CH2
CH
CH
CH3
O
F
CH3
CH2
CH2
F
CN
CH
C
CH
O
CH2
CH2
O
CH2
O
CH2
CH2
NO2
polyethylenglycol-2-nitroterephtalate
O
CH2
O
CH
N
H H
O
O
CH2
O
O
C
CH2
CH2
O
C
O
CH2
CH2
CH2
C
CH3
CH3
C
O
CH3
H
N
C
CH3
CH2
polyethylenglycol
CH3
Si
Si
CH2
CH3
Si
cyanopropyl
Si
CH3
CH2
CH2
O
Detektory w chromatografii gazowej
termokonduktometryczny – pomiar zmiany
przewodności drutu umieszczonego w strumieniu gazu
nośnego – uniwersalny, ale mała czułość
FID
płomieniowo-jonizacyjny – pomiar prądu jonizacji –
wykrywa związki spalające się w płomieniu (nie
wykrywa np. wody), mała czułość
ECD
wychwytu elektronów – zawiera źródło radioaktywne –
selektywny wobec związków zawierających
ugrupowania łatwo polaryzowalne, jak chlorowce lub
grupy nitrowe, wysoka czułość, mały zakres liniowości
NPD, FTD azotowo-fosforowy, płomieniowo-termojonowy –
zawiera sól alkaliczną (Rb lub Cs), której obecność
ułatwia jonizację związków azotu i fosforu, duża
czułość na związki zawierające N lub P
FPD
płomieniowo-fotometryczny – rejestruje światło o
charakterystycznej długości fali, emitowane przez
związki siarki i fosforu
TEA
pirolityczno-chemiluminescencyjny – selektywny
detektor NO
MS
spektrometr mas
TCD
Chromatograf cieczowy (HPLC, SEC)
detektor spektrofotometryczny UV
detektor refraktometryczny
zespół pryzmatów
źródło światła
czujnik
kolumna I
kolumna II
czujnik
celka pomiarowa
lampa deuterowa
zlewki
eluent
filtr
piec
płuczka ultradźwiękowa
zespół pomp
zawór odpowietrzający
pętla dozująca
zawór dozujący
Detektory w chromatografii HPLC
UV-VIS
spektrofotometr UV-VIS, dość uniwersalny, dobra czułość,
szeroki zakres liniowości, możliwość pracy przy różnej długości fali
DAD
jw. z matrycą diodową, jednoczesny pomiar w całym spektrum
RID
refraktometr różnicowy, najbardziej uniwersalny, mała czułość,
wrażliwy na zmiany parametrów eluentu
PMDE
elektrochemiczny, duża selektywność i czułość
TEA
chemiluminescencyjny, selektywny na nitrozwiązki
CI-MS
spektrometr mas z jonizacją chemiczną
TSP-MS
spektrometr mas z odparowaniem rozpuszczalnika
DVD
wiskozymetr różnicowy – pomiar lepkości stosowany w SEC
LALLS
detektor rozpraszania światła – do pomiaru masy cząsteczkowej w SEC
Fazy stacjonarne w HPLC
O
HO
OH
OH
Si
Si
O
O
O
OH
Si
Si
O
O
Si
O
O
OH
O
Si
O
O
Si
C18H37
Si
O
OH
polarna (normal phase – NP)
niepolarna (reverse phase – RP)
podstawowy eluent:
n-heksan, cykloheksan
modyfikatory:
2-propanol, chloroform,
dichlorometan, THF
podstawowy eluent:
woda
modyfikatory:
metanol, acetonitryl, THF,
bufory, sole
oznaczenie
Si
Si
NO2
NH2 (APS)
układ faz
NP
wypełnienie
OH
Si
Si
NP
NO2
OH
Diol
Si
CN (CPS)
NP
NH2
Si
O
NP
OH
CN
NP/RP
C2
Si
C8
Si
RP
C18 (ODS)
Si
RP
SB
Si
SA
Si
RP
+
IE
O
OH
S
O
IE
N
Dobór warunków detekcji UV

HMX
Kryteria:
rozpuszczalność próbki
wybór długości fali
przezroczystość rozpuszczalnika
szybkość analizy
szumy
350
340
330
320
310
300
290
280
270
260
250
240
230
220
210
200
•
•
•
•
•
długość fali,  /nm
rozpuszczalnik
aceton
acetonitryl
chloroform
czterochlorek węgla
dichloroetan
dioksan
kwas octowy
metyloetyloketon
octan etylu
gęstość
3
g/cm
0.818
0.782
1.500
1.590
1.250
1.033
1.049
0.805
0.901
lepkość
cP (20°C)
0.32
0.37
0.57
0.97
0.79
1.54
1.26
0.40
0.45
wsp. załam.
światła, 
1.359
1.344
1.443
1.466
1.445
1.422
1.372
1.381
1.370
 graniczna rozp. HMX (25°C)
g/100g roztw.
UV /nm
330
2.2
190
1.98
245
0.003
265
0.002
225
0.125
220
0.144
0.037
330
0.46
260
0.02
Dobór warunków detekcji UV dla izomerów

długość fali,  /nm
punkt izozbestyczny
350
340
330
320
310
300
290
280
270
260
250
240
230
220
210
200
24DNT
26DNT
Warunki detekcji dla mieszaniny związków
względny współczynnik ekstynkcji
100%
80%
NG
DPA
DBP
60%
DNT
40%
20%
0%
200
250
300
350
długość fali  /nm
warunki minimalne: 216/230/280nm, optymalne: 216/230/250/280nm
– konieczna zmiana  w trakcie analizy!
Badanie układów celuloza-przeciwutleniacz
przeciwutleniacze fenolowe
O
OH
OH
OH
HO
O
OH HBHT
BHT
HO
BHA
OH
THBP
O
OH
HO
O
HO
OH OG
OH
O
OH
O
LG
Dzięki obecności pierścieni aromatycznych związki wykazują silną absorpcję UV.
detektor refraktometryczny (współczynnik załamania światła)
uniwersalny, ale mało czuły, wrażliwy na zmiany temperatury i rozpuszczalnika
detektor spektrofotometryczny UV
specyficzny, mało wrażliwy na zmiany temperatury i przepływu, duży zakres liniowości
Optymalizacja warunków analizy HPLC przeciwutleniaczy
UV 230 nm
UV 280 nm
RI
kolumna Phenomenex Luna 3m C18 o długości 15 cm, temperatura 55°C, detektor 1
UV 230/280 nm, detektor 2 RI
eluent 5%CH3COOH(A):metanol(B) w stosunku:
analizowany związek
THBP
BHA
OG
HBHT
BHT
LG
stosunek A:B
40:60
35:65
35:65
30:70
10:90
10:90
Krzywe kalibracyjne dla badanych przeciwutleniaczy
3,5-di-tert-butylo-4-hydroksytoluen (BHT)
4000000
BHT
280 nm
2,6-di-tert-butylo-4-hydroksymetylofenol (HBHT)
sygnał
detektora
/j.u.
3-tert-butylo-4-hydroksyanizol (BHA)
2,4,5-trihydroksybutyrofenon (THBP)
galusan oktylu (OG)
galusan laurylu (LG)
2000000
0
0
40
80
3
stężenie substancji /(mg/dm )
Optymalizacja warunków analizy azotanów
eluent
składnik A
składnik B
stężenie
całkowite /mM
NaHCO3
Na2CO3
3,5
KH2PO4
Na2HPO4
5
3,5
H3citr
Li3citr
5
pH
przepływ
3 –1
/cm s
temperatura /°C
9,0
1,0
35
8,3
1,0
35
7,4
1,0
35
7,0
1,0
35
6,5
1,0÷2,0
35÷50
6,5
1,6
50
5,7
1,0
35
5,0
1,0÷2,0
35÷50
4,45
1,0÷2,0
35÷50
4,05
2,0
50
Wyniki analizy chromatograficznej
UV 220nm
UV 300nm
konduktometr
–
NO3
0
5
10
czas, t/min.
15
20
sygnał det. UV /j.u.
100000
1500
1000
50000
500
0
0
0
200
100
stężenie NO3– /m g·dm 3
spektrofotometr UV
konduktometr
0,2÷200 mg/dm3
2÷200 mg/dm3
sygnał det. konduktometryc znego /j.u.
Kalibracja
Metody ekstrakcji kory
A:
Próbka o masie 5g umieszczona została w aparacie Soxhleta i
ekstrahowana wodą przez 2h.
B:
Próbka o masie 1g poddana była gotowaniu w wodzie przez 30
min.;
C:
Próbka o masie 1g została próżniowo nasycona wodą, przy
czym cykl obniżania ciśnienia i nasycania powtórzony był 3krotnie.
D:
Próbka o masie 1g została próżniowo nasycona wodą i
umieszczona w zamrażalniku na 3h, rozmrożona i poddana
jeszcze dwóm cyklom zamrażania i rozmrażania.
E:
Próbka o masie 1g została umieszczona w płuczce
ultradźwiękowej na 30 min.
Opis polimerów
(niejednorodność masy cząsteczkowej, stopnia polimeryzacji)
średnia masa cząsteczkowa polimeru:
liczbowa
n M

n
i
Mn
wagowa
i
i
i
Mw 
 mi M i
i
m
i
i
polidyspersja
z-średnia
Mz 
3
n
M
 i i
i
2
n
M
 i i
i
i

2
n
M
 i i
i
n M
i
i
i
Mw
D
Mn
lepkościowa
  n i M1i 
 i

Mv  

n
M
  i i 
 i

1

Chromatografia wykluczania przestrzennego
(żelowa, SEC, GPC)
Fazy stacjonarne
Najczęściej stosowana:
PS/DVB:
polistyren sieciowany
diwinylobenzenem
Inne:
szkło, krzemionka,
sieciowane polimery akrylowe,
dekstrany
Mechanizm rozdziału w SEC
zależność kalibracyjna
6
5
4
3
5
6
7
8
9
10
11
12
5
6
7
8
9
10
11
12
sygnał detektora
Dla cząsteczek o większych
rozmiarach dostępna jest
mniejsza objętość porów,
skutkiem czego jest mniejsza
objętość retencji.
Zakres wielkości
rozdzielanych cząsteczek
zależy od rozmiarów porów
fazy stacjonarnej.
Rozdzielczość wypełnienia
ograniczona jest z góry
granicą wykluczania, a z dołu
granicą rozdzielania żelu.
log(M/kD)
Mechanizm SEC
objętość elucji /ml
Kalibracja w SEC
Z.Grubisic, P.Rempp, H.Benoit, J. Polym. Sci. B, Polym. Lett., 5 (1967), 753
Kalibracja w SEC
Kalibracja bezwzględna
Seria wzorców wąskodyspersyjnych (najczęściej polistyren)
Ograniczona dostępnością wzorców
Kalibracja szerokim wzorcem (korygowana)
Wymaga próbki oznaczanego polimeru o znanych co najmniej
dwóch parametrach: Mn , Mw , [] lub dwóch próbek
Kalibracja oligomerów i związków małocząsteczkowych
Rozdział na poszczególne pasma, którym można przypisać
właściwą M.
Jako parametr uniwersalny proponowana jest objętość molowa.
Kalibracja w SEC
Kalibracja uniwersalna
Wymaga detektora wiskozymetrycznego
Pomiar  oraz znane c dają [] – bezwzględne oznaczenie M
Kalibracja “uniwersalna” (pseudouniwersalna)
Wymaga znajomości współczynników K i 
w warunkach oznaczenia (rozpuszczalnik, temperatura)
1


1


X
PS
K X MX
 MX []X  MPS[]PS  K PSMPS
K P S 1  P S
1
log M X 
log

log M P S
1  X
K X 1  X
kalibracja
Graniczna liczba lepkościowa
Równanie Marka-Houwinka-Kuhna
[]  KM
   0 1 

[]  lim 
c  0  0 c 

Iloczyn []M jako uniwersalny parametr kalibracyjny
Objętość hydrodynamiczna kłębka polimeru w warunkach rozdziału
[]M
Vh 
  NA
(r. Einsteina)
[]M  
 
2 3 / 2 (teoria Flory’ego-Foxa)
r
Detektory w chromatografii polimerów
RID
refraktometr różnicowy, najbardziej uniwersalny, mała czułość,
UV-VIS
spektrofotometr, dość uniwersalny, dobra czułość,
szeroki zakres liniowości, możliwość pracy przy różnej długości fali
DVD
wiskozymetr różnicowy
pomiar lepkości (granicznej liczby lepkościowej)
RALLS
detektory rozpraszania światła
LALLS
sygnał zależy od masy cząsteczkowej
MALLS
możliwość bezwzględnego pomiaru
spektrofotometr UV




mierzy właściwość badanego związku (nie roztworu)
mało wrażliwy na zmiany temperatury i przepływu
wykazuje dużą czułość wobec związków absorbujących w UV
duży zakres liniowości (104) umożliwia jednoczesne oznaczanie
składnika głównego i śladów
 może wystąpić wrażliwość na zmiany przepływu, a także
mogą pojawić się piki substancji nie absorbujących w UV,
co związane jest ze zmianą współczynnika załamania światła
(zmiana natężenia odbić od powierzchni bocznych)
 nie stosuje się zazwyczaj celki odniesienia ze względu na
wprowadzany dodatkowy szum
refraktometr różnicowy





mierzy różnicę właściwości roztworu badanego i odniesienia
duża wrażliwość na zmianę składu i przepływu eluentu
bardzo wrażliwy na zmiany temperatury (termostatowanie ±0,001°C)
detektor uniwersalny, lecz mniej czuły od UV (2 rzędy)
dla M > 10 kD można przyjąć niezależność reakcji detektora od M
Celuloza i pochodne
R
O
O
R
R
O
O
O
*
O
*
O
O
O
O
R
R
n
R
celuloza R = H
triazotan celulozy R = NO2
tri(fenylokarbaminian) celulozy R =
H
N
C
O
Analiza SEC celulozy w papierze
papier siarczynowy
papier na bazie
celulozy z bawełny
1903r.
Franciska Sundholm, Maria Tahvanainen, Journal of Chromatography A, 1008 (2003) 129–134
Analiza celulozy z detekcją RI/LS
B.Wittgren. B.Porsch,
Carbohydrate Polymers,
49 (2002), 457
Degradacja termiczna celulozy
A.M. Emsley, M. Ali, R.J. Heywood, Polymer, 41 (2000) 8513–8521
Analiza oligomerów
S.V.Greene, V.J.Gatto,
Journal of Chromatography A,
841 (1999), 45
Chromatografia oligomerów
1° chromatografia wykluczania przestrzennego (SEC)
brak oddziaływań z fazą stacjonarną
decyduje konfiguracja przestrzenna
2° chromatografia adsorpcyjna (LAC)
decydują oddziaływania z fazą stacjonarną
3° chromatografia w warunkach krytycznych (LCCC)
kompensacja efektów sterycznych
i oddziaływań z fazą stacjonarną
Dobór eluentu umożliwia realizację wszystkich
trybów chromatografii na tej samej kolumnie
Zależności kalibracyjne w chromotografii oligomerów
LCCC
log(M/Da)
5
LAC
4
SEC
0
5
10
15
objętość elucji /cm3
W trybie SEC objętość retencji maleje ze
wzrostem M, w trybie LAC rośnie, w
trybie LCCC nie zależy od M!
W LCCC objętość retencji może zmieniać
się z funkcyjnością badanego oligomeru.
20
rozpuszczalnik
3
sygnał d etektora /j.u.
HO~OH
25
-
30
2
R~OH
4
6
czas retencji /min.
8
Odwrotna SEC dla żeli
P.DePhillips, A.M.Lenhoff,
Journal of Chromatography A,
883 (2000), 39
Odwrotna SEC dla celulozy włóknistej
włókno
CLY1
CLY2
CLY3
mCMD
objętość porów
(ml/g)
0.59/0.47
0.71/0.62
0.70/0.57
0.49/0.49
powierzchnia właściwa
(m2/g)
430/310
462/404
490/400
332/368
średni rozmiar porów
(nm)
28/30
31/31
29/28
29/26
A. Kongdee, T. Bechtold, E. Burtscher, M. Scheinecker, Carbohydrate Polymers, 57 (2004) 39–44
Dobór warunków analizy estrów kalafonii
bremasin 1260
UV 265 nm
RI
Estry kalafonii i gliceryny lub trietylenoglikolu.
kolumna: Nucleogel 500-10, eluent: chloroform, detektor UV 265nm
Badanie składu mieszanin estrów kalafonii
6
7
brem as in 1260
50:50
brem as in 1380
50:40
kalafonia
50:20
8
9
czas retencji /min.
10
zawartość wolnej kalafonii:
bremasin 1380
~1%
bremasin 1260
~12%
11
6
7
8
9
czas retencji /min.
10
11
zastosowano numeryczną
dekonwolucję (rozplot) pików
błąd oznaczania składu:
0,2÷2,3% (bzwgl.)
 publikacja (Annals of Warsaw Agricultural Unversity, Forestry and Wood Technology)