Transcript 61 生理学方法及其在中医研究中的应用

第六章 实验中医学
常用实验方法及其应用
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许多初涉中医实验研究的人，最大的问题是不知
道如何着手研究、观察什么指标。
比如，发现某张中药复方治疗肝癌，临床报道有
效，打算开展实验验证其疗效，揭示其作用机制，怎
么办？从何入手？
选用哪些实验室检测指标，为什么，实施具体步
骤如何？
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本章介绍实验中医学的常用实验方法和技术，以及
应用这些方法研究中医的典型范例。
希望通过集中对常用具体实验方法的介绍，让大家
了解不同学科主要方法、异同，各自的特点和优势，以
及相互间的联系，学会如何根据需要选择不同的方法或
不同方法的组合。
各节中的研究现状和范例，希望对如何应用具体某
一实验手段研究中医有比较具体的认识，通过典型范例
的介绍分析，使这种认识更加深化。
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教学要求：
1．掌握生理学、形态学、生物化学、分子生物学
等不同学科实验研究方法的特点和优势。
2．掌握依据实验研究的不同目的，选择合适的实
验技术和综合多种技术。
3．了解生理学、形态学、生物化学、分子生物学
的主要方法及其在中医研究中的应用。
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了解不同实验方法与技术的原理十分重要。这有助
于因地制宜地选择适当的实验方法；而且，由于受到实
验室条件、技术支撑的限制，例如检测设备昂贵、技术
难度大等，许多实验室会将一些实验委托专业公司或实
验室开展。此时，了解那些实验方法与技术的原理有助
于对合作单位技术、条件的考查，协议与合同的拟定，
以及实验数据的分析。
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第一节 生理学方法及其在
中医研究中的应用
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本节的教学目的和要求：
1．掌握生理学实验研究方法的特点和优势。
2．了解生理学的主要方法及其在中医研究中的应
用。
3．掌握依据实验研究的不同目的，选择合适的生
理学实验技术和综合多种技术。
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推荐一些参考书目：
[1]沈岳良主编. 现代生理学实验教程[M]. 北京：科学出版社,
2002.
[2] 方福德等主编. 现代医学实验技巧全书（下册）. 北京医科
大学中国协和医科大学联合出版社. 1995.
[3] 徐叔云等主编. 药理实验方法学. 人民卫生出版社. 1994.
[4] 韩济生主编. 神经科学纲要. 北京医科大学中国协和医科大
学联合出版社. 1993.
[5] 陈次青. 生理学. 人民卫生出版社. 1991.
[6] 季钟朴主编. 现代中医生理学基础. 学苑出版社. 1991.
[7] 周衍椒等主编. 生理学方法与技术（第一～三集）. 科学出
版社. 1984, 1987.
[8] 梅懋华等主编. 生理学方法与技术（第四集）. 科学出版社.
1986.
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生理学是研究生命现象机制的自然科学。由于生物
学科的迅速发展，解剖学、形态学、生物化学、药理学、
细胞生物学、分子生物学等纷纷独立出来，使当代生理
学演变成为主要以研究物理性功能为主的生物物理学。
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一、生理学的主要方法
容易联想到巴甫洛夫系列狗的
条件反射实验、小鼠行为学研究、
航天领域动物失重生理学观察，等
等。丰富了生命科学的手段和内容。
现代生理学研究方法：在人工
控制的实验条件下对生命活动进行
客观观察和科学实验。
I.P.巴甫洛夫（俄国人，1904年）
从事有关消化系统生理研究
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生理学根据研究时程的不同，可分为急性实验和慢
性实验：
① 急性实验：包括离体组织、器官实验，其优点
是可以人工控制条件，有利于排除其他因素，专对某器
官、组织的基本功能和生理特性进行较细致的观察与分
析。其缺点是器官、组织脱离了动物整体，或动物受解
剖或麻醉的影响，因此所得结果常有一定的局限性。
② 慢性实验：是在完整的正常动物机体上对某种
生命现象进行观察和实验研究。这种方法所得资料更符
合正常的生理活动规律，但实验的难度大、要求高。
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生理学根据研究层次的不同，又可以分为整体水平、
器官水平和细胞水平等3个水平。
生理学根据研究系统的不同，又可以分为神经、内
分泌、心血管、呼吸、消化、泌尿等系统生理实验方法。
教材主要介绍电生理常用仪器和若干系统的生理研
究方法：
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（一）生理学实验常用仪器
生理学实验仪器一般由五大部分组成，即刺激系统、
探测系统、信号调节系统、记录系统和机体（或离体组
织）生命维持设备。
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1．刺激系统
为使机体或离体组织细胞兴奋，需要给予刺激，常
用的刺激装置为电子刺激器。电子刺激器包括刺激电极，
后者有普通电极、保护电极、乏极化电极之分。
注意：除电生理外，其他刺激因素或干预因素，可
以是药物（试验用药物、某一受体或通路的阻断剂等）、
其他物理因素等。
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电子刺激器产生的刺激脉冲多用矩形波，可调参数
包括：① 幅度（强度）；② 波宽（时间）；③ 频率；
④ 延迟（从触发脉冲到矩形波刺激之间的一段时间）；
⑤ 同步输出，用于触发示波器的外触发扫描，也可用
于触发其他需要与刺激同步的仪器启动工作；⑥ 刺激
方式，包括单刺激、连续刺激及双脉冲刺激等。
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2．探测系统
当生理信号是电信号时，探测系统可以是引导电极，
包括记录单细胞电活动的玻璃微电极，以及记录群细胞
电活动的金属电极。
当生理现象为其他某种能量形式时，如机械收缩、
压力和声音等，探测系统又可以是换能器，如张力换能
器、压力换能器、绑带式呼吸换能器、呼吸流量换能器，
还有脉搏、温度、心音等换能器。
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3．信号调节系统
信号调节系统是一种放大器或放大器的组合，有前
置放大器、微电极放大器等
因此必须加接一个高保真放大的生物电放大器将这
些微弱信号先行放大，方能在示波器或记录仪上观察或
描绘出生物电信号的变化波形。
生物电放大器应具备下列性能：① 频率响应范围
大（通频带从0～100kHz）；② 有足够的放大能力；③
高的辨差比；④ 低噪声；⑤ 高输入阻抗。
经典实验中各式各样的杠杆和传动装置也起着信号
调节作用。
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4．显 示、记录
系统
记录系统通常使
用记纹器、示波器或
记录仪。记纹器是一
种经典的记录装置，
已被示波器或记录仪
取代。由于计算机技
术的发展，计算机生
物信号采集系统在生
理实验中已广泛应用，
有代替刺激器、放大
器、示波器和记录仪
的趋势。
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（1）阴极射线示波器：该仪器是
用来观察与测量电压、电流波形与数
值大小的一种电子仪器。由于它的惰
性小，灵敏度高，测量的频率范围又
很宽，所以在电生理实验中用来显示
微弱而变化迅速的生物电。根据生物
电特点，示波器应为高灵敏度，扫描
速 度 慢 （ 2s/cm~1μs/cm ） ， 频 率 为
1MHz。有条件的实验室，可用数字存
贮示波器代替普通示波器。它能把信
号以数字形式存贮起来，随意调出。
而且可以长时间显示在荧光屏上以利
于分析和照相。它可以把信号数据直
接送入通用计算机接口，也可以把存
贮数据模拟输出，连接记录器描记出
生物电位。
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（2）多道生理记录仪：多道生理记录仪是可以同
时观察、记录、处理生物电，例如脑电、心电、肌电，
以及血压、呼吸、肌肉收缩曲线等多种生理变化参数的
综合性电子仪器。多道生理记录仪一般由传感器（输入
部分）、前置（前级）放大器、控制器、信号放大部分
（后级放大器）、显示和描记部分（示波监视器、记录
仪），及机架与电源供应等不同部分组成，国内常用的
有二道、四道、八道记录仪。
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（3）生物信号采集处理系统：这是一种基于计算
机的专用生物电数据采集和处理仪器，已经日益广泛地
作为生理实验强有力工具。它主要用于各种生物电如神
经动作电位、心电、脑电、肌电，各种诱发电位，以及
血压、脉搏、呼吸等通过换能器转换来的生理参数电信
号的测量，能对上述各种信号进行实时处理，具有波形
采集、叠加平均、资料分析、记忆示波等多种功能，是
教学和科研的有用工具。
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（4）膜片钳实验装置：做膜片
钳实验除了一般电生理所需的仪器外，
特殊的仪器有膜片钳放大器、倒置显
微镜、三维液压微操纵器、微电极拉
制仪和计算机及相关软件等。因为膜
片钳实验所用的标本多数是放在培养
皿中的细胞，需要在相差倒置显微镜
下，借助微操纵器进行操作。膜片钳
放大器内通常含有一个标准的差分放
大器线路，将记录到的电流以电位差
的形式输出，所以膜片钳放大器的核
心部分是一个高增益的电流-电压转
换器，具有高输入阻抗、低躁声、宽
频带等特性。此外，还有频率提升部
分、加法器、瞬时补偿和钳位放大器
等部件组成。
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膜片钳装置和检测到的信号
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膜片钳装置和检测到的信号
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5．机体或离体组织生命维持设备/保障系统
动物人工呼吸机；恒温槽；小肠平滑肌、血管、气
管和子宫等离体组织灌流装置；Langendorff心脏离体灌
流装置；神经屏蔽盒等。
体外组织灌流和生理检测系统
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此外，生理学还广泛涉及一些专门用途的实验设备，
例如阻抗血流仪、微循环仪、血气分析仪、电解质检测
仪等；而计算机与有关支持软件也愈来愈普及地被使用，
涉及生物信号记录分析系统、图像处理系统、多媒体、
局域网等。
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（二）生理学实验常用方法
根据生理学研究的层次不同，如中枢神经系统、神
经与肌肉、内分泌与生殖、心血管与循环、血液、呼吸、
消化、感觉器官、代谢、排泄、泌尿等系统，发展并分
类成许多不同的实验方法。
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1．神经系统
电生理学方法是研究神经或神经-肌肉机能状态的
常用方法。尤其是细胞外记录方法，利用可兴奋组织
（如神经、肌肉）的生物电现象，观察组织细胞的正常
功能、病理变化及药物的作用。细胞外记录法是把引导
电极安放在神经、肌肉组织的表面或附近，引导神经、
肌肉组织的电活动。由于可兴奋细胞兴奋时其兴奋的部
位产生去极化，未兴奋的部位处于正常极化状态，在容
积导体中的两部位间由于电位不同，电流从一点流向另
外一点，放置于细胞表面的电极就会记录出两者之间所
产生的电位差。
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屏蔽室和正在引导的大鼠听力电信号
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2．循环系统
无创伤心功能测定（包括心电图ECG、心音图PCG、
颈动脉搏动描记曲线CPT和心尖搏动图ACG）、心室肌
收缩功能的测定、血管张力测定、脉搏图的测定等方法
是常用的方法。用微循环显微镜系统进行甲襞微循环观
察的方法是研究血瘀证的常用方法。
大鼠尾血压测量仪
甲襞微循环观察
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3．呼吸系统
通过呼吸运动描记方法，可以测定肺功能状况，这
些方法包括胸腔内压记录、胸廓运动记录、呼吸肌活动
及肌电图描记、呼吸气流速度测定等方法。例如观察
“肺气虚”时肺功能受损情况，或通过检测肺泡组织中
一些理化因子的变化探究肺的通调水道的理论，这些方
法都是经常使用的。
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4．消化系统
胃肠电图和胃肠运动波的记录方法能反应胃肠功能
状况，是研究“脾主运化”的常用方法；木糖吸收试验
和唾液淀粉酶活性测定已被公认为脾气虚证的客观方法。
胃肠电图仪
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二、实验中医学应用生理学方法的现状与
案例
长期以来，中医学形成了一整套独特的理论与方法，
诸如藏象、经络、气血津液等，与当代西医学有所异同。
例如“肾藏精”、“主生殖”、“主水液”、“肾通于
脑”、“肾开窍于耳”，按现代生理学的观点看，这里
的肾是一个宽泛的生理概念，包括内分泌、生殖和泌尿
等系统的功能。
这些理论的物质基础是什么？本质是什么？是否还
蕴涵着人类至今尚未认识的生命现象和规律？以及基于
中医理论采用针灸、中药复方、中药及其有效成分的作
用机制是什么？这些构成了采用生理学方法研究的主要
动因。
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20世纪60年代起，我国针麻与针灸镇痛原理的研究；
70年代起，肾与耳原理的研究，以及80年代起，脾功能
的研究等。
（一）肾的研究
肾阳虚证具有下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴上不同环
节（层次），不同程度的功能紊乱；进一步的研究涉及
到甲状腺轴与性腺轴功能，推论肾阳虚证的主要发病环
节为下丘脑（或更高中枢）的调节功能紊乱。
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1．肾与耳的关系
《灵枢·脉度篇》说：“肾气通于耳，肾和则耳能
闻五音矣。”肾虚引起的耳鸣、耳聋及链霉素中毒性耳
聋用补肾方法防治取得一定效果。
那么，中医肾与耳关系中的肾在结构和功能上究竟
指的是什么？又是通过什么生理机制来达到这种联系？
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（1）肾与耳关系物质基础的现代理论假说及其实
验
1）醛固酮与肾和耳的关系
研究背景：① 肾脏和内耳中的某些细胞在生理功
能、形态结构、酶的含量以及药物反应等方面均有相似
的特性。② 对内耳有毒性的抗生素（如新霉素、卡那
霉素等）对肾脏亦有毒性作用。③ 抑制肾功能的利尿
剂（如利尿酸、速尿）同样可以使人和动物耳聋，并对
内耳生物电产生明显的抑制作用。④ 先天性肾功能障
碍（Alport综合征）常伴随先天性耳聋。⑤ 晚期肾功能
不全患者也常出现听力下降。
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肾脏与内耳中
某些组织在功
能和药物与疾
病反应方面的
共同特性
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假说：调节肾功能的盐皮质激素——醛固酮可能在
肾主耳的机制中起重要作用。
实验：采用声音引起的豚鼠耳蜗微音器电位CM
（听毛细胞感受器电位）和听神经动作电位N1为指标，
采用利尿酸（耳毒性利尿剂）造成内耳病理模型，及分
别采用醛固酮治疗干预和安体舒通（醛固酮受体竞争性
拮抗剂）干预，观察醛固酮是否发挥作用。
结果：醛固酮可显著拮抗利尿酸对内耳生物电的抑
制；安体舒通（醛固酮受体竞争性拮抗剂）则明显增强
利尿酸对内耳生物电的抑制作用。
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醛固酮对15分贝短声引起的豚鼠听神经动作电位N1振幅变化曲线
纵坐标—电压（μv），横坐标—时间（min）， 箭头为注射EA；
×—对照组，△—醛固酮组，●—安体舒酮组。
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醛固酮对15分贝短声引起的豚鼠微音电位CM振幅变化曲线
纵坐标—电压（μv），横坐标—时间（min）， 箭头为注射EA；
×—对照组，△—醛固酮组，●—安体舒酮组。
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分析：醛固酮增加内耳细胞ATP酶的活性和促进细
胞的氧化过程。
进而利用同位素示踪技术，测定了3H-醛固酮在豚
鼠耳蜗及身体其他组织中的含量、分布及衰减过程，结
果表明3H-醛固酮在耳蜗基底膜（包括柯蒂氏器）及血
管纹中的含量较高、衰减过程慢，其时相变化与小肠、
肾等醛固酮靶组织相似，说明耳蜗组织中可能有醛固酮
受体存在，密切了肾与耳的关系。
思考：存在什么问题，进一步该如何深入？
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2）甲状腺激素与肾和耳的关系
研究背景：① 甲状腺功能降低的患者出现典型的
肾阳虚；② 肾虚患者的尸检发现有甲状腺功能低下的
表现；③ 肾阳虚的动物造模可见甲状腺重量下降、组
织退化；④ 肾阳虚患者血清中三碘甲状腺原氨酸（T3）
含量降低；⑤ 补肾助阳的中药能改善甲状腺机能减退
动物的能量代谢；⑥ 先天性与后天性甲状腺功能不足
的患者，伴有不同程度的听力下降；⑦ 先天性甲状腺
功能降低（克汀病）者，内耳与中耳发育障碍；⑧ 甲
状腺素具有减轻卡那霉素和庆大霉素（氨基糖苷类抗生
素）对听觉功能的损害作用。
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假说：甲状腺激素是维持听觉功能的重要因素，增
加外源性甲状腺激素可以增强内耳对一些致聋耳毒性药
物的抵抗力。
方法：采用豚鼠，设正常对照、甲状腺给药、切除
甲状腺3组，观察内耳生物电（听神经电位、微音器电
位）、内耳形态学、细胞琥珀酸脱氢酶（SDH）的活性，
以及对利尿酸（耳毒性利尿剂）反应及调节作用。
结果：① 给予适当剂量甲状腺素的动物，内耳抵
抗能力比正常动物大，而切除甲状腺的动物抵抗能力最
差；② 利尿酸能抑制听毛细胞中的琥珀酸脱氢酶；③
利尿酸造模后，服甲状腺素组动物该酶的活性最强，对
照组次之，切除甲状腺组最弱。
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3）缺铁与肾和耳的关系
（2）补肾药防治耳聋对“肾主耳”理论的反证
2．肾虚与内分泌
（1）肾虚证与下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴。
（2）肾虚证与下丘脑-垂体-性腺轴。
（3）肾虚证与下丘脑-垂体-甲状腺轴。
3．肾虚证与免疫
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（二）脾的研究
1．胃肠动力学研究 钡餐、体表胃电图检测。胆碱
能迷走神经、胃泌素、胆囊收缩素、胃动素；交感-肾
上腺系统、促胰液素、胰多肽、舒血管肠肽。
2．胃肠激素 胃泌素、P物质（SP）、血管活性肠
肽（VIP）、胃动素、生长抑素（SS）、神经降压素
（NT）、胰腺外分泌功能（血清淀粉酶及其胰型同工
酶、脂肪酶）。
3．胃肠道消化吸收 D-木糖吸收率/排泄率；血清
总蛋白、白蛋白、血清游离氨基酸、必需氨基酸、支链
氨基酸等含量。
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4．血液流变学 血液的流动性和黏滞性——血液在
血管内的流量、流速和流态；微循环障碍。
5．免疫功能 细胞免疫功能、免疫调节机制、消化
道局部免疫功能、红细胞免疫功能。
6．肌肉 能量产生及能源物质、无氧酵解；I型肌
纤维有氧氧化效率的显著下降；Ⅱ型肌纤维的糖原含量
锐减，糖酵解能力下降；M-ATPase含量降低；骨骼肌
肌纤维明显变细；其骨骼肌无力，与运动神经元及运动
神经传导无关，而与神经肌肉接头的传递及骨骼肌本身
有关，障碍可能发生在神经-肌肉接头的突触后膜。
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三、展望
应用现代生理手段研究中医传统理论已经开展了数
十年，通过广泛的研究，把揭示生命奥秘的探索推向更
深入，尤其在中医藏象、气血理论以及病证的研究方面
应用广泛，取得可喜的成绩。
如何运用现代生理学技术进一步阐明中医理论的精
髓，是摆在我们面前的一个迫切问题。随着计算机技术、
分子生物学技术、细胞生物学技术向生理学的渗透，近
年来生理学实验手段、方法有了新的发展，生理学的研
究方法已应用于细胞水平的研究，同时学科之间的交叉、
渗透，研究生理现象时借助于其他学科的方法、指标，
使研究结果更为丰富、可靠。可以预计，随着大量的新
技术、新方法的引入，生理学在中医药现代化的进程中
必将发挥积极的作用。
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