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제6강 랫드 제 1장 생물학적인 특성 서울대학교 박재학 교수 주요 분류와 역사적 고찰 • Rodentia목 Muridae과 Rattus norvegicus • 130종 이상 – R. norvegicus 크고 공격성강함 18세기에 유럽에, 19세기에 아 메리카에 – R. rattus 12세기에 유럽에, 16세기에 아메리카에 • 1800년대 – rat baiting • • • • 1865년 알비노 랫드를 이용하여 부신제거술의 영향을 연구 J. M. Philipeaux Wistar 협회 연구에서의 사용 • 마우스 다음으로 의학과 행동학 연구에서 가장 빈번하게 사용되는 포유류 – – – – 랫드는 짧은 임신기간 짧은 수명 유순한 행동 건강상태와 유전적 배경이 잘 알려져 있다 • 제약 회사들과 정부기관에서 수행되는 독성학, 기형학, 발암 실험에서의 표준 종 • 행동학, 신경학, 영양학, 내분비학 연구 • 적당한 크기 때문에 장기 이식에서 혈관술에 이르는 다 양한 수술분야에서 사용 • 근교계 랫드는 질환 모델 이차 구획 (Secondary Enclosures) • 20-24℃ • 30-70%의 습도 • 10-15회/hr의 깨끗한 공기의 환기 일차 구획 (Primary Enclosures) • 바닥이 철망으로 된 케이지 • 편평한 바닥 – polycarbonate와 polypropylene • 깔집 – 딱딱한 나무조각, 갈은 옥수수대, cellulose sheet 위생 • 바닥이 편평한 케이지 • 일주일에 1-2회씩 세척 • 적은 횟수의 세척 – 사육 밀도가 낮거나 분만 전후의 사육, 환기가 가능한 케이지를 사용하는 경우 일반적인 외형 • 노르웨이 랫드 – 작고 두꺼운 귀 – 체장의 85% 정도 길이의 긴 꼬리 • R. rattus – 더 큰 귀와 몸보다 더 긴 꼬리 • 털 – 긴 털이 짧은 털보다 드문드문하게 나 있다. – 휴지기와 성장기가 각각 17일로 주기적 • 유두 – 12개 – 3쌍은 가슴에 3쌍은 배에 존재 • 크기 – Sprague-Dawley가 Wistar보다 크고 Fischer 344가 이 두 비근교계보 다 크기가 더 작다 시각기관 • 눈 – – – – – 앞쪽으로 돌출 외상으로 인한 상처와 마취로 인한 건조의 위험 눈꺼풀은 잘 발달 오직 각막만 볼 수 있다. 2가지 색의 시각을 가지고 있다 • Harderian 선과 누관 – 안와 내측에 위치 – 각막을 촉촉한 상태로 유지 – Chromodacryorrhea • Harderian 선은 동물이 스트레스를 받았을 경우(e.g. 영양상태가 좋지 않거 나, 탈수, 질병, 또는 다른 환경요인으로 인해서) porphyrin을 다량으로 분비 • 붉은 분비물 또는 눈 주위와 코 주변의 딱지는 질병과 사육 문제의 유용한 지시계 • 후안와정맥총 – 안와의 내측 아래쪽에 있다 후각 • 행동의 강한 결정 요인 • 수컷 랫드는 후각을 통해 다른 수컷들의 사회적 지위와 발정기의 암컷에게 친근감 을 인지 청각 • 70dB에서 랫드의 청각 주파수 범위 • 250Hz부터 70-80kHz • 가장 민감한 영역 – 8kHz부터 32kHz • 이런 높은 주파수 감지 능력으로 인해 어 미로부터 떨어진 새끼, 또는 성적인 행동 과 폭력적인 행동시의 성숙 랫드는 22-80 kHz의 소리에 반응할 수 있다 골격 • 척주 – – – – – 7개의 경추 13개의 흉추 6개의 요추 4개의 천추 27-30개의 미추 소화기 계통 • 랫드의 치식 – • 2(I 1/1, C0/0, PM0/0, M 3/3) 침샘 – 이하선 • – 악하선 • – 점액선이며 악하선의 앞쪽에 존재한다. 위 – – – • 혼합선으로 하악골의 뒤쪽모서리와 thoracic inlet 사이에 배쪽으로 존재 설하선 • • 장액성이고 3개 또는 4개의 엽으로 구성되며 하악골의 뒤쪽모서리에서 쇄골 쪽 배쪽 외측으로 위치 위샘이 없는 전위(위 분문부) 위샘이 있는 위체부(유문부) 위 내의 융선이 두 부분을 나누며, 융선의 접힌 부분은 랫드가 토하지 못하는 것과 밀접한 연 관 간 – – – – – 중간엽 외측우엽 크기가 큰 좌엽 작고 식도를 둘러싸고 있는 꼬리엽 담낭이 없고, 각 엽으로부터 나온 담즙관은 공통 담관을 형성하고 십이지장의 유문괄약근으 로부터 약 25mm 떨어진 지점과 연결 호흡기 계통 • 상악오목(동) – 상악골과 사골의 외측벽 사이에 위치 – 외측 코샘(Steno's gland)이 있다. • 비갑개의 주둥이쪽 끝부분에서 묽은 분비물을 분비 • 코 상피의 점액층의 점성을 조절 • 폐 • 왼쪽 폐와 앞쪽, 중간, 덧, 뒤쪽 엽으로 구성된 오른쪽 폐 • 기관지 근육에 아드레날린성의 신경을 가지고 있지 않기 때문에 기관지 수축은 미주신경에 의 해 조절 비뇨생식계통 • 숫컷 – 요도구선 (Cowper's glands) – 전립선 • 암컷 – 양각 자궁 • 신장 – 오른쪽 신장 • 왼쪽신장보다 더 위쪽으로 위치 • 앞쪽모서리가 1번 요추에, 뒤쪽모서리가 3번 요추에 위치 – 단일유두(unipapillate) – 신장 피질에 표면 네프론이 존재 – 생체 내에서 미세천자법을 통한 네프론 이동 연구에도 넓게 쓰인 다. Rat kidney section This image is a microscopic view of a rat's kidney. The rat kidney has superficial nephrons that can be punctured easily using microscopic techniques. This characteristic makes rats attractive for kidney research, because other animals usually have less accessible nephrons 중추신경계 • 뇌는 큰 후각망울과 매끈한 대뇌, 두개골의 이주 위낭(periotic capsule)의 깊은 구멍에 위치하는 소뇌의 2개의 곁타래엽(parafloccular lobe)을 가진다. • 시상하부는 시각교차 뒤에 존재하며 뇌 뒤쪽에 속이 빈 줄기같은 누두형태로 붙어있다. • 뇌실은 다른 동물과 비슷하나 랫드는 ‘Magendie foramen’이 없다. • 척수는 4번째 요추에서 끝나며 섬유종말의 끝은 셋째 꼬리 신경 뒤쪽이다(Greene, 1949). 심혈관계 • 심장은 흉곽의 중심선에 위치하며, 끝부분 은 횡격막 근처에 있고 외측면은 폐로 둘 러싸여 있다. • 심장은 셋째, 넷째 늑골 사이의 흉벽에 노 출되어 있어서, 심장채혈에 유용하다. 정상 생리치 • 특정 랫드 그룹의 정상 생리는 오직 그 기 원과 계통에서만 정확하다. • 나이, 병원균 상태, 시료 채취 방법, 계통 의 관리 상태와 같은 요인들 또한 정상 생 리 수치의 중요 변수 영양 • • 사료의 성분에 의한 분류 자연 성분 – – – – – – • 대부분의 연구에 가장 널리 사용되는 형태 농작물과 부산물로 구성 자연 성분 사료에서의 영양 성분 구성은 다양한 요소들 때문에 생산시기별로 다르다 (e.g. 곡물의 비교 가격, 날씨, 수확과 저장 상태, 오염물질의 농도). 독성학 연구와 Good Laboratory Practice (GLP) 연구에 이용 대다수의 성분이 평가되었고 연구 결과에 영향을 미칠 수 있는 오염물질들의 최고농도를 넘 지 않도록 허가되었기 때문 정제 성분 – – – 하나의 영양성분 또는 비슷한 종류로 구성되어 다양성이 떨어진다 (e.g. 카제인, 당, 전분, 식물기름, 셀룰로오스). 랫드에서 흔히 이용되는 정제 사료는 AIN-76이다. • • 단점은 더 비싸고 맛이 좋지 않은 경우도 있다는 것 화학적 성분 – – – 기본적으로 정의된 성분으로 이루어져 있다 (e.g. 특정한 아미노산, 당들, 중성지방, 필수 지방산). 비싸고, 잘 먹지 않는다 • 자유급식형태(ad libitum) – 자유 급식시 섭취하게 되는 사료 양의 70-80%만을 공급한 랫드 보다 수명이 단축 – 암 발생율도 증가 – Sprague-Dawley, Wistar, F-344에서 보고 – 2년간의 발암시험과 안전성 평가 시험에서 변이를 증가시켜 위 험도 평가에서 생물학적 검정의 유용성을 저하시켰다 • 16주 때부터 자유급식형태의 섭취량의 80%를 급여한 Wistar 랫드 • ad libitum 보다 폐, 유두, 췌장 세포, 뇌하수체 종양이 크게 감소 – 악성 종양의 발생은 사료 제한 그룹에서는 16%, 자유급식 그룹 에서는 37% – 제한급이 • 만성 염증, 심장의 섬유화, 급성 전립선염, 신경근병증 (radiculoneuropathy), 유선의 선포성 증식(acinal hyperplasia)이 감소 생식 생리 • vaginal plate – 질이 질판이라고 불리는 치밀 상피로 막혀 있다 – 이것은 20-35일령에 퇴화되고 각질화되기 시작하여 40-80일령에 완전히 열린 다. – 질판의 존재는 때때로 불임을 초래한다. • 사춘기 – – – – • 생존 가능한 새끼를 키울 수 있는, 성 성숙이 시작되는 시기 성체의 체격과 체중으로 다 자라기 전 수컷에서보다 암컷에서 일찍 일어나고 무리와 계통에 따라 다양성을 보인다. 45-47일 배란주기 – 4-5일 – 후분만 발정과 함께 일 년 내내 이루어진다. – 각각의 단계가 약 1일 • 발정기(estrus), 발정후기(metestrus), 발정사이기(diestrus), 발정전기(proestrus) • 발정전기 – • 자궁이 액체로 부풀어 오는 것처럼 보일 수 있는데, 특히 성 성숙기의 랫드에서 더 두드러진다. 이 상태는 자궁수종과 혼돈될 수 있다. 배란 – 발정기에 들어선 후 약 8-11시간 정도에 대부분 자정이나 새벽 2시 사이 – 난자는 약 10-12시간정도 생존할 수 있다 • 정소 하강 – • 정자 – • 질 도말을 통한 정자 확인, 질전의 관찰 또는 직접적인 성행위 착상 – • 어두운 곳에서 더 많이 일어나고 어두워지기 시작하는 초반보다 후반에 더 많이 일어난다 삽입 횟수가 적을수록 암컷의 임신율은 떨어진다. 일반적으로 7회의 연속 삽입과 사정이 일어나고, 성공할 때마다 무반응기는 길어진다. 교배 확인 – • 약 45-46일령에 처음으로 만들어지지만, 수정(성성숙)은 약 62-65일령 전에는 일어나지 않 고 75일령 전까지는 정자 생성이 최대치를 이루지 않는다 성 행위 – – – • 약 15일령에 복강에서 음낭으로 배반포가 자궁내막에서 수정 후 4-7일 사이에 일어나며, 완벽한 착상은 12-24시간의 과정 이 걸린다 분만 – – 교배 21-23일 후 timed pregnant 발정과 임신의 발견 • 발정 랫드 – 종종 머리나 등을 만졌을 때 귀를 떨거나 골반 부위에 자극을 주 었을 때 척주전만 자세를 취하는 것(상체를 젖히는 자세)과 같은 특정한 행동을 보여준다 – 외음부가 붓고, 발정후기와 발정사이기에는 분비물이 맑고 분홍 색을 보이던 질벽이 발정기 때는 건조해 진다 • 질 도말을 통한 세포검사 • 교류저항 측정기(impedance meter) – 질액과 세포의 변화는 발정기 동안 질 내의 전기적 저항에 변화 • 임신 초기의 임신 확진 – 수태율은 85% 이상 – 10일 후, 조심스럽게 촉진하면 태아를 발견할 수 있다. – 임신 14일에는 유선과 유두의 발달이 뚜렷 관리 • 근교계 랫드 – 각 케이지 당 암수 한 쌍 또는 암컷 두 마리와 수컷 한 마리로 키운다. • 비근교계 랫드 – 일부다처로 키운다. • • 분만 후 새끼를 식살하는 것을 최소화하기 위해 분만 며칠 전에 다른 케이지 로 옮겨 놓는 것이 좋다. 난소 기능과 발정 주기는 광주기에 영향을 받는다. – 지속적인 빛은 지속적인 발정과 황체 형성이 없는 낭포성 여포가 난소에 만들어 지게 된다 – 강도의 빛을 지속적으로 비추면 질 개구가 빨라지고 난소 퇴화를 가져온다 • • 칼로리 제한, 자유급식량의 15-30% 정도의 칼로리 섭취는 발정주기의 중 단과 성성숙의 지연을 초래 높은 환경 온도 – 정세관 상피세포의 비가역적인 퇴화 – 수컷의 불임 – 4일령 랫드를 26.6℃정도의 낮은 온도에 지속적으로 노출시킨 경우에도 같은 손 상이 일어난다. 분만 • 분만전 – – – – 분만 약 5일 전에 둥지 짓는 행동이 증가 포유기간 동안에도 계속된다 사용가능한 재료는 무엇이든지 사용 케이지 안에 따로 재료를 넣어줄 필요는 없다. • 분만 – 첫 번째 새끼가 태어나기 약 1.5-4시간 전에, 질에서 투명한 점액이 분 비 – 초기진통 – 케이지 안을 걷고 스트레칭을 한다 – 이후 암컷은 배를 깔고 누워 케이지 바닥으로부터 뒷다리를 신장한다 – 새끼가 태어나는 동안, 암컷은 산도에서 태반을 꺼내 먹는다. – 분만은 평균 1-3.5시간 정도이지만 산자 수에 따라 달라진다. – 육아는 일반적으로 모든 새끼가 태어난 후 곧바로 이루어진다. • 산자 수 • 무리, 계통, 기원, 어미의 나이에 따라 다양 • Wistar BH 랫드는 35일령에 첫 교배(평균 산자 수 10.11마리)를 했 을 때보다 105일령에 첫 교배(평균 산자 수 11.80마리)를 했을 때 평균 1.69마리의 더 많은 새끼를 낳는다 • 2회 차 산자가 일반적으로 가장 많다 • 9개월 령 이후 산자 수는 점차 감소하며, 12개월 령 이후에는 임신 율이 감소한다 • 임신소모(pregnancy wastage)라고 불리는 태아의 사망은 산모의 나이와 상관관계가 있으며, 4개월 령 랫드에서는 5%이하이고, 9개 월 령에서는 30%, 11개월 령에서는 65%에 이른다. • 태아의 손실은 주로 착상 전과 초기 착상 직후에 많이 일어난다. • 노화에 따른 산자수의 감소 경향과 대조적으로, 처녀 생식 랫드에서 의 모성행동은 3-4개월 령 랫드보다 19-20개월 령 랫드에서 증가 한다 • 모체의 스트레스는 태아의 손실을 유발 신생아의 초기 발달 • 신생 랫드 • 털이 없고, 눈을 뜨지 않았으며, 사지가 미성숙 하며, 꼬리가 짧고, 이도가 막혀있다 • 태아의 체중과 산자 수는 반비례 • 태아 체중을 감소시키기 위해 주입된 실험 물질 이 태아 사망률을 감소시킬 수도 있기 때문에 생 식 독성학자에게 중요 • 105일령에 교배된 어미의 새끼는 35 또는 70일 령에 교배된 어미의 새끼보다 이유시기에 체중 이 더 나갔던 것으로 보고 • 청각 – – • 치아 – • 출생 시 망막은 잘 발달되지 않고, 사람 태아의 4-5개월 때와 비슷하다. 망막이 30-40일령 전까지 잘 발달되지 않는 반면, 눈꺼풀은 약 14-17일령에 열리며, 전안 방의 최종 구성성분들은 60일령 전까지 완벽히 형성되지는 않는다 피부 – – • 어금니는 16일령(어금니 1), 18일령(어금니 2), 32-34일령(어금니 3)에 나는 반면, 앞니는 6-8일령 경에 난다 시각 – – • 외이도는 2.5-3.5일령에 열린다. 태어날 때부터 소리를 낼 수 있지만 소리를 처음 듣는 것은 약 9일령 경 약간의 털이 출생 시 몸에 나 있을 수 있으며, 솜털을 덮고 있는 보호털이라 할 수 있다 7-10일령에 완전히 털이 난다. 항체 – – – 어미의 항체는 자궁 내에서 난황을 통해 수동 면역이 이루어진다 항체는 젖먹이 새끼에서 어미의 모유(초유)을 섭취하여 장 점막을 통해 전해질 수 있다. 이 전달은 태생 후 짧은 기간에 낮은 비율로 이루어지며, 14일령에 최고율에 도달하고, 21일 령(gut closure)에 멈춘다 성감별 • 회음부를 직접 관찰 • 수컷은 항문과 음경꺼풀의 개구부 사이에 뚜렷 한 음낭을 가지고 있다. • 음경은 종종 보이기도 하며 암컷 요도의 돌기보 다 더 크다. • ‘항문 음경 간 거리’는 수컷이 암컷보다 더 길다. • HY항원의 항체의 존재로 인해 수컷배아의 발달 은 중지되지만, 항체를 세척하면 발달이 다시 시 작 • HY 항체가 있는 상태로 배아에서 발달한 80%의 배반포는 배반포가 착상된 후 암컷 새끼를 생산 이유기 • 20-21일이지만, 빠르면 17일 정도 • 17일 전에는, 어미의 자극 없이는 배뇨할 수 없고 이유기에 폐쇄성 요로 장애 질병 에 걸릴 수도 있다. 발정 동기화(同期化 • 40㎎의 methoxyprogesterone을 음수 (200㎖ ethanol/liter water, 매일 갈아준다) 에 넣어 6일 동안 투여하고 동시에 1 IU의 임신마혈청(pregnant mare's serum)을 근 육주사 • 다수의 '시간 지정 임신 랫드'를 생산하는 데 발정 동기화는 유용하지만 대부분의 경 우 교류저항 측정기(impedance meter)를 사용하는 것이더 실용적 인공 수정 • 랫드에서의 인공수정(AI)은 정액의 빠른 응고로 인해 어렵다. • 특히 전기자극으로 유도된 사정을 통해 얻어진 정액의 경우 응고샘 과 정낭샘으로 인해 더욱 인공수정이 어렵다 • 이 샘들은 인공 수정시 임신율을 떨어뜨리지 않고 수술로 제거될 수 있다. • 정자는 부고환으로부터 직접적으로 얻을 수도 있지만 각각의 수컷 랫드 한 마리에서 두 번 이상 채취할 수는 없다. • 부고환 미부의 근위 부분으로부터 얻은 정자는 중간 또는 원위 부분 에서 얻은 것보다 더 높은 수정율을 가진다고 발표된 바 있다 • 한번 채취된 정자는 발정기 암컷의 자궁으로 수술적으로 주입해야 한다 • AI 성공을 위한 필수적인 단계는 암컷을 정관을 절제한 수컷과 교배 시키거나, 질의 기계적 자극, 또는 경부의 전기적 자극을 통한 대리 모의 위임신을 유도하는 것이다 배아 이식 • 산도의 병원균을 없애기 위해 제왕절개의 대안으로 널리 사용 • 특정 랫드가 갖는 특성이 단순히 유적적인 요인이 아니라 자궁 내 환 경에 의해서 변화되는지의 여부를 조사하기 위해서도 사용 • 배아 이식을 위해서 배아는 자궁으로부터 암컷이 교미한지 2-4일 후에 수집 • PBS와 BSA로 배아를 세척 • trypsin은 첨가하기도 한다. – 병원균을 제거 • 배아를 BSA와 fetal calf serum을 넣은 PBS에 넣고 위임신 대리모 의 자궁이나 난관에 수술적인 방법으로 이식 • 자궁경을 통해 배아를 비수술적 이식하는 방법이 발표 • 시험관 수정(in vitro fertilization, IVF)은 랫드에서 시행되나 군집관 리보다 수정이나 초기 발달에 관한 연구에서 주로 사용된다 • 정자 세포를 개별의 난자에 미세주입하는 IVF의 한 변법은 운동성이 있는 정자를 생산하지 못하는 마우스의 계통을 보존하기 위해 사용 되는데 랫드에서 적용이 기대된다. 냉동 보존 • 유전적으로 변형된 랫드를 유지시키는데 효과적인 방법 • 냉동 배아는 배양물질을 개발하거나 사람 IVF의 환경을 시험하는데 사용 • 2세포기부터 상실배(morula) 까지의 배아 를 가장 빈번하게 냉동 보존 • 랫드의 정자를 냉동 보존하는 것은 어렵다 행동 • CD, SD, Lewis와 같은 Sprague-Dawley 계 랫 드는 갈색 노르웨이나 F-344 랫드보다 일반적으 로 더 온순하다. • 부드럽게 다룰수록 온순함이 증가하고 반면 거 칠게 다루면 사나운 반응을 일으킬 것이다. • handling으로 인한 스트레스 – 행동학적 반응변화를 유도 – 초음파적 발성(22kHz 범위)을 유도 – 가청범위 내 있는 다른 랫드의 취급을 더 어렵게 만들 수 있다. • 새끼도 어미와 신호하기 위해, 귀가 충분히 발달 하기 전에 초음파적 범위로 발성한다 • 활동 – 밤에 가장 활동적 – 오후보다 아침에 더 활동적 – tail flick test 꼬리 튕기기 시험 • 암컷 랫드는 어두운 시간의 중간기와 발정기 그리고 발정후 기 동안에 더 짧은 tail flick 반응을 갖는다. • 분식 – 분변을 먹으며, 분변의 섭취량은 개체마다 차이가 크 다. – 분변 배출량을 측정하거나 어떤 물질의 흡수량을 측 정 할 때에 중요 – 철의 흡수에는 아무 영향이 없다.