Transcript ดร. ยิ่งมณี ตระกูลพัว

่
ดร. ยิงมณี
ตระกูลพัว
้
่ อโรคใน
การเพาะเลียงไวร
ัสทีก่
คน สัตว ์
1. สัตว ์ทดลอง หนู กระต่าย ลิง
้
- ฉี ดเชือเข้
าทางช่องท้อง, สมอง, ใต้
ผิวหนัง
- หยอดทางจมู ก
• Suckling Mice
อายุ 3 วัน
้
• การเพาะลียงในสั
ตว ์ทดลองควบคุมการ
แพร่กระจายได้ยาก
แต่ไวร ัสบางชนิ ดจาเป็ นต้องใช้สต
ั ว ์ทดลอง
- ดูพยาธิสภาพในหนู
ex. Coxsackie virus A, B
CAV เกิด Flaccid paralysis
CBV เกิด Spastic paralysis
่
- ไม่สามารถใช้ host ชนิ ดอืนได้
้ Hepatitis B ในลิง
ex. การเพาะเลียง
CBV เกิด Spastic paralysis
้
การเก็บเชือไวร
ัสจากสัตว ์ทดลอง
้
้
การเก็บเชือไวร
ัสจากการเพาะเลียงใน
สมองหนู
้
บดสมอง + อาหารเลียงเซลล
์
้
ปั่ นแยก, ทิงเซลล
์สมอง
ที่ 4 องศาเซลเซียส
เก็บไวร ัสใน supernate ที่ -70 องศา
เซลเซียส
2. ไข่ฟัก อายุระหว่าง 10-14
วัน
ไวร ัสสามารถเจริญได้ในส่วน
ต่างๆของไข่ฟัก
-ถุงหล่อตัวอ่อน (amniotic sac)
-ถุงหล่อรก
(allantoic sac)
-ถุงไข่แดง
(yolk sac)
Virus inoculation
chorioallantoic
membrane
amniotic sac
yolk sac
allantoic sac
้
ช่องทางฉี ดเชือไวร
ัส
ไวร ัส
Aminotic, Allantoic sac
Yolk sac
เชือ้
Influenza,
mump virus
Herpes simplex virus
Chorioallantoic membrane
HSV,Small pox
Virus inoculation
เก็บไวร ัสจาก
Allantoic sac
้
การเพาะเลียงไวร
ัสบริเวณ
Chorioallantoic membrane
เตรียม artificial air sac
เก็บ Chorioallantoic
่ ดเชือ้
membrane ทีติ
ไวร ัส
Pock บริเวณ Chorioallantoic
membrane
HSV pock
Vaccinia pock
Pock: จุดสีขาวของกลุ่มเซลล ์ติดเชือ้
้
3. เซลล ์เพาะเลียง
•
•
•
•
้
เพาะเลียงไวร
ัส
เตรียมว ัคซีน
เตรียมแอนติเจน
์
ศึกษาฤทธิของยาต้
านไวร ัส และกลไก
การก่อโรค
้
เซลล ์เพาะเลียง
1. Primary cell
line
2. Diploid cell line
3. Continuous cell
line
1. Primary cell line
้ั
เตรียมได้เป็ นครงแรกจากอวั
ยวะคน หรือ
สัตว ์
้
เช่น ไต ปอด ผิวหนัง กล้ามเนื อ
- fibroblast cell
- epithelial cell
้ ง
ข้อดี- ความไวในการแยกเชือสู
(รู ปร่าง, โครโมโซมเหมือนอวัยวะต้น
กาเนิ ด)
้ วนของอวัยวะมักตายหลัง
ข้อเสีย - ชินส่
2. Diploid cell line
• ต้นกาเนิ ดจาก primary cell line
ex. MRC-5 (Medical Research Council
5)
จาก Human embryonic lung
้ ง
ข้อดี- ความไวในการแยกเชือสู
- ทราบแน่ นอนว่าไม่กอ
่ มะเร็ง ไม่มไี วร ัส
แฝง
จึงเหมาะกับการใช้เตรียมวัคซีน
้
3. Continuous cell line
่
• ต้นกาเนิ ดจากการเปลียนแปลงเป็
นเซลล ์มะ
เร็วของ diploid cell line
ex. HeLa cell จากเซลล ์มะเร็งปากมดลู ก
BHK-21 cell จาก baby hamster
kidney
ข้อดี- subculture ได้หลายร ้อยครง้ั
่
ข้อเสีย- คุณสมบัตเิ ปลียนไปมากท
าให้ความไว
ในการแยกเชือ้
ลดลง
- คุณสมบัตเิ ป็ นเซลล ์มะเร็ง จีงไม่นิยม
้
การเพาะเลียงเซลล
์
้
• อาหารเลียงเซลล
์ – กรดอะมิโน, วิตามิน,
เกลือแร่, buffer, indicator (phenol red)
ยาปฏิชวี นะ (penicillin, streptomycin)
้
ยาฆ่าเชือรา
(amphotericinB หรือ
fungizone)
growth factor (calf serum, epidermal
growth factor)
• เซลล ์ – monolayer, suspension
้
เลียงเซลล
์ในขวดแก้ว, ขวดพลาสติก, petri
dish,
test tube
่ คาร ์บอนไดออกไซด ์ 5-10 %
ในภาวะทีมี
ภาชนะสาหร ับ
• Subculture monolayer cell โดยใช้ proteolytic
enzyme: trypsin, collagenase
• สามารถเก็บเซลล ์ไว้ได้นานใน freezing medium:
้
อาหารเลียงเซลล
์ + glycerol/ dimethyl sulfoxide
Chinese Hamster Ovary Cell Culture
้
การเก็บเชือไวร
ัสจากเซลล ์
้
เพาะเลียง
้
• เก็บจากอาหารเลียงเซลล
์ (extracellular
virus)
• เก็บ infected cell
้
เติมอาหารเลียงเซลล
์
ทาให้เซลล ์แตกโดย freeze-thaw
้
์ ที่ 4 องศา
ปั่ นแยก, ทิงเซลล
เซลเซียส
เก็บไวร ัสใน supernate (intracellular virus)
ไว้ท ี่ -70 องศาเซลเซียส หรือในไนโตรเจนเหลว
(-196 องศาเซลเซียส )