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CHAPTER FIVE
Amplifying DNA :
PCR and cell-based DNA
cloning
면역학 실험실
석사1년 지혜진
Chapter contents






5.1
5.2
5.3
5.4
The importance of DNA cloning
PCR : basic features and applications
Principles of cell-based DNA cloning
Cloning systems for amplifying different
sized fragments
5.5 Cloning systems for producing singlestranded and mutagenized DNA
5.6 Cloning systems designed to express
genes
5.1 The importance of DNA cloning
5.2 PCR : basic features and
applications



PCR : Polymerase Chain Reaction의 약
자로 유전체에 있는 특정 DNA서열을 대량
으로 증폭시킬 수 있는 방법이다.
PCR방법은 Kary Mullis에 의해 고안되었
으며 이 업적으로 1993년 노벨상을 수상
하였다.
PCR은 클로닝 과정 동안 살아있는 세포를
이용하지 않고 시험관 내에서 원하는 DNA
서열을 클로닝 하기 위해 사용된다.
5.2.1 principles of basic PCR and
reverse transcriptase (RT)PCR
(1) PCR의 원리
주형이 되는 double strand DNA의 표적부분의
양끝 염기배열정보로부터 상류와 하류의 DNA
primer를 합성하고 내열성 DNA polymerase
(Taq polymerase)와 thermocycler를 이용해
PCR반응에 따른 특정 유전자 영역의 증폭을 실
시한다. 이론적으로는 반응 사이클의 2n으로 증
폭이 가능하다.
5.2.1 principles of basic PCR and
reverse transcriptase (RT)PCR
(2) PCR의 구성요소
① temple DNA : 증폭대상이 되는 DNA.
② Primer : DNA 중합효소가 DNA 합성을 개시하게 하는 짧은
외가닥 DNA로 증폭할 부분을 결정한다. 일반적으로
17-30mer가 primer의 크기로 적당하다.
③ dNTPs : dATP, dCTP, dGTP, dTTP로서 DNA를 합성하는
재료가 되는 각 뉴클레오티드 염기들.
④ Taq polymerase : 열에 특별히 강한 DNA중합효소.
Taq polymerase 은 94℃까지 올라가는 PCR과정에서도 변성이
되지 않지만 proof-reading기능이 없어서 error rate가 매우 높다.
그래서 최근엔 proof-reading exonuclease활성을 지닌
Pfu polymerase를 많이 사용한다.
5.2.1 principles of basic PCR and
reverse transcriptase (RT)PCR
(3) PCR의 과정
① denaturation : 반응액을 가열하여 주형DNA를 single
strand로 만든다. 일반적으로 94℃정도에서 1분간 진행된다.
② primer annealing : 적정 온도(Tm)로 냉각하여 두 가닥으로
분리된 DNA에 primer를 결합시키는 과정이다. 적정온도는
primer의 길이와 그것을 이루는 염기의 종류에 따라 달라지
며 보통 50℃~70℃로 냉각시킨다.
Tm = (4x[G+C]) + (2x[A+T])
③ DNA synthesis : Taq polymerase가 주형 DNA로 부터 상보
적인 새로운 DNA사열을 합성하는 과정이다. 일반적으로
74℃에서 2분간 진행되며 이 온도가 Taq polymerase의 활
성이 최대가 되는 온도이다.
5.2.1 principles of basic PCR and
reverse transcriptase (RT)PCR
(1) RT-PCR의 원리
RT-PCR법은 PCR법과 역 전사 효소 반응을 혼합한 방
법으로 세포에서 추출한 mRNA에서 cDNA를 합성하고
이것을 주형으로 하여 PCR법으로 증폭하는 기술이다.
이 방법은 Northern blot hybridization에 의한 RNA분석
보다 실험방법이 더욱 간단할 뿐 아니라 유전자의 염기
서열결정이 가능하기 때문에 주로 mRNA의 염기서열 및
전사량을 연구할 때 크게 도움이 된다.
5.2.1 principles of basic PCR and
reverse transcriptase (RT)PCR
(2) RT-PCR의 과정
① 세포 조직에서 추출한 mRNA의 poly A에 oligo dT
primer를 결합시켜 역 전사 효소를 이용해 cDNA를 합성
한다.
② 주형 cDNA에 대한 DNA primer를 결합시켜 double
strand DNA를 합성한다.
③ thermocycler를 이용해 PCR법으로 증폭한다
5.2.2 PCR has two major limitation :
short sizes and low yields of
products
(1) short sizes
일반적으로 PCR로 증폭시키고자 하는 DNA의 길이는
3kb이하여야 하며 1kb이하가 이상적이다. 단편의 길이
가 길어질수록 증폭 효율이 낮아지며 항상 일관된 결과
를 얻기 어려워진다.
Long-range PCR을 사용하면 5~40Kb의 DNA도 증폭
할 수 있다.
이 PCR법에서는 polymerase를 두 개 사용하는데 그 중
하나가 minor-proofreading을 할 수 있어서 긴 DNA를
증폭할 때 error rate을 감소시켜 준다.
5.2.2 PCR has two major limitation :
short sizes and low yields of
products
(2) low yields of products
PCR산물의 말단은 클로닝 벡터에 쉽게 삽입될 수 있는
blunt 말단이 아니라 Taq polymerase에 의해 각 사슬의
3’말단에 아데노신을 가진 A overhang말단이다.
이것은 PCR산물의 cloning을 어렵게 만든다.
이에 따른 두 가지 해결책은 추가적인 T를 포함하고 있는
특수한 클로닝 벡터를 사용함으로써 증폭된 DNA단편을
ligation시키는 것과 T4 polymerase나 Pfu polymerase
와 같이 single nucleotides를 가진 overhang말단을 제
거할 수 있는 ‘polishing’ 효소를 사용하는 것이다.
5.2.3 General application of PCR

It is very rapid and easy to perform

It is very sensitive

It is very robust
5.2.3 General application of PCR
5.2.3 General application of PCR
▶
Allele-specific PCR
5.2.3 General application of PCR

Touchdown PCR
이 방법은 PCR할 때 Tm을 알기 위해서 하는 PCR방법이다.
PCR과정에서 매 2 cycle마다 annealing temperature을
1℃낮춘다.
일반적으로 annealing 이 Tm에서 1℃만큼 차이가 난 온도
에서 일어날 때 한 cycle에 product의 양이 두 배정도 차이
가 난다.
Touchdown PCR에서는 2 cycle마다 온도를 낮췄으므로
1℃에 product의 양이 4배가 차이 나는 셈이다.
이것을 이용해서 Tm을 알 수 있다.
(즉 온도가 1℃내려갔을 때 product양이 4배 증가한 과정에
서의 temperature가 Tm이 된다.)
5.2.3 General application of PCR

Hot start PCR
Taq1 polymerase는 37℃에서도 그 활성이 좋기 때문에 간혹 가다
가 첫 번째 denaturation 과정이 완전히 진행되기도 전에 primer가
DNA molecule에 붙어서 extension이 일어나는 경우가 있다.
이렇게 낮은 온도에서 annealing이 일어날 경우 primer가 mismatch
할 확률이 높고 따라서 결과적으로 정확도가 떨어지는 band를 얻게
된다.
이것을 막는 방법이 Hot start PCR을 이용하는 것이다. Hot start
PCR에서는 primer 가 정확하게 원하는 DNA site에만 붙을 수 있도
록 충분한 온도가 된 후에 PCR이 일어나도록 필요한 물질을 넣어준
다
5.2.3 General application of PCR

Inverse PCR
기존에 서열을 알고 있는 DNA의 양 옆에 서열을 알지 못하는 region이
있고, 이것을 알고자 할 때 많이 이용된다.
이 방법은 primer가 기존의 PCR과는 반대방향으로 실시하는 방법이다.
제일먼저 제한효소로 자르고 자른 부위를 원으로 만든다.
그 원으로 된 곳에 primer를 붙이는데 이때 신장이 같은 방향으로 가도
록 primer를 붙인다.

Alu-PCR
이 PCR법은 human DNA에서 3kb마다 생겨나는 서열인 Alu repeat
에 특이적인 primer를 사용하는 것이다.
Alu repeat 부위들이 인접하게 되면 반대방향으로 향하게 되며 single
type의 Alu primer들이 작용하여 이사이 서열을 증폭한다.
5.2.3 General application of PCR
5.3 principles of cell-based
DNA cloning
(a)
5.3.1 An overview of cell-based DNA
cloning
Construction of recombinant DNA molecules
(b)
Transformation
(c)
Selective propagation of cell clones
(d)
Isolation of recombinant DNA clones

5.3.1 An overview of cell-based
DNA cloning
5.3.2 Restriction endonucleases enable the target DNA
to be cut into manageable pieces which can be joined
to similarly cut vector molecules

Restriction endonucleases
DNA에 존재하는 특정한 염기서열을 인식하고 인식한 서
열부위 또는 그 근처에 존재하는 특정부위를 절단한다.
제한효소는 원래 세균이 자신의 세포 내로 침입해 들어오
는 바이러스 같은 외부 DNA를 제거하기 위한 방어기전
으로 가지고 있는 것이며, 자신의 DNA는 절단부위의 염
기를 메칠화시켜서 자신의 제한효소가 자신의 DNA를 자
를 수 없게 보호하고 있다.
제한효소는 3가지로 나눌 수 있으며, 실험실에서 사용되
는 것은 대부분 type II이다.
5.3.2 Restriction endonucleases enable the target DNA
to be cut into manageable pieces which can be joined
to similarly cut vector molecules

Type II restriction nucleases
▶ Type I , Type III restriction enzyme
DNA의 특정부위를 인식하긴 하지만 인식된 부위가 아닌 다른 부위
를 절단한다. 즉, 인식부위는 특이성을 가지지만 그로부터 약 1,000
base pair가 떨어진 부위를 절단하기 때문에 원하는 부위를 선택하
여 자르기가 어렵다. 따라서 이 효소들은 박테리아의 기능에는 중요
하지만 실험목적으로는 잘 사용되지 않는다.
▶ Type II restriction enzyme
인식부위와 절단부위가 모두 특이성이 있는 제한효소이므로 분자생
물학 연구에 아주 유용하게 이용되고 있다. 대부분의 type II 제한효
소는 4개, 5개, 또는 6개의 염기서열을 인식하는데, 이에 따라 DNA
상에 인식부위가 나타나는 빈도가 달라지게 된다.
5.3.2 Restriction endonucleases enable the target DNA
to be cut into manageable pieces which can be joined
to similarly cut vector molecules
5.3.2 Restriction endonucleases enable the target DNA
to be cut into manageable pieces which can be joined
to similarly cut vector molecules
5.3.2 Restriction endonucleases enable the target DNA
to be cut into manageable pieces which can be joined
to similarly cut vector molecules

Simple vectors for cloning in bacterial cells
▶ plasmids
박테리아 세포내에서 독립적으로 존재하는 이중
나선의 원형 DNA분자
▶ bacteriophages
박테리아을 특별하게 감염시키는 바이러스
5.3.3 introducing recombinant DNA into
recipient cells provides a method for
fractionating a complex starting DNA
population
5.3.4 DNA libraries are a comprehensive set of
DNA clones representing a complex starting
DNA population

Genomic DNA libraries
5.3.4 DNA libraries are a comprehensive set of
DNA clones representing a complex starting
DNA population

cDNA libraries
5.3.5 Recombinant screening is often
achieved by insertional inactivation of
a marker gene
▶PCR-based screening
5.3.5 Recombinant screening is often
achieved by insertional inactivation of
a marker gene
▶PCR-based screening
5.4 Cloning systems for amplifying
different sized fragments
5.4.1 standard plasmid vectors provide a simple way of
cloning small DNA fragments in bacterial (and simple
eukaryotic)cells

Plasmid vector
박테리아 세포 내에서 독립적으로 존재하는 이중나선의
원형 DNA분자
플라즈미드는 항생제 저항유전자같이 하나 또는 하나이
상의 유전자를 가지고 있으며 이러한 유전자는 숙주 박
테리아 에서 나타나는 유용한 특성의 원인이 된다.
모든 플라즈미드는 복제시작점을 가지고 있기 때문에 박
테리아 염색체와는 무관하게 세포 내 에서 늘릴 수 있다.
일반적인 플라즈미드 벡터는 0~5kb까지 삽입할 수 있다.
5.4.1 standard plasmid vectors provide a simple way of
cloning small DNA fragments in bacterial (and simple
eukaryotic)cells

Map of plasmid vector pUC19
5.4.2 Lambda and cosmid vectors provide an efficient
means of cloning moderately large DAN fragments in
bacterial cells

Phage λ vector
▶ 용균성 감염 : 대부분의 박테리오파지는 증식형
감염을 일으킬 때 숙주세포를 죽이면서 병원성
을 나타내는 감염 특징을 가짐.
▶ 용원성 감염 : 또 다른 박테리오파지는 증식형
감염뿐만 아니라 숙주세포를 죽이지 않고 지속
적인 감염 특징을 가짐 (Persitent infection).
5.4.2 Lambda and cosmid vectors provide an efficient
means of cloning moderately large DAN fragments in
bacterial cells

Phage λ vector
5.4.2 Lambda and cosmid vectors provide an efficient
means of cloning moderately large DAN fragments in
bacterial cells

Phage λ vector
5.4.2 Lambda and cosmid vectors provide an efficient
means of cloning moderately large DAN fragments in
bacterial cells

Cosmid vector
▶플라즈미드와 람다파아지로 이루어진 혼성체로서 플라즈
미드에 cos site가 삽입된 클로닝 벡터이다.
그러므로 대장균세포에서 자율적으로 복제하는 플라스미
드능력과 시험관내에서 람다염색체를 싸는 능력을 가진
다.
▶게놈의 클로닝을 보다 용이하게 한 것으로 파아지 벡터가
수용할 수 있는 크기보다 3배정도 큰 30~44kb정도의
DNA절편을 수용할 수 있다.
5.4.2 Lambda and cosmid vectors provide an efficient
means of cloning moderately large DAN fragments in
bacterial cells

Cosmid vector
5.4.3 Large DNA fragments can be cloned in bacterial
cells using vectors based on bacteriophage P1 and F
factor plasmids

Bacteriophage P1 vector and P1 artificial
chromosomes (PACs)
▶ Bacteriophage P1은 110kb의DNA를 그것의 캡 시드
구조에 끼워 넣을 수 있는 것이 람다에 비해 큰 장점이다.
P1에 기초한 코스미드벡터는 70~100kb크기까지의
DNA단편을 클론하는데 사용되었다.
5.4.3 Large DNA fragments can be cloned in bacterial
cells using vectors based on bacteriophage P1 and F
factor plasmids

Bacterial artificial chromosome(BAC) vectors
▶박테리아의 [fertility(F)]요소로부터 만들어졌다.
300kb이상의 큰 크기의 DNA단편을 넣을 수 있으며 플
라즈미드나 람다 코스미드 벡터와 같이 대장균에서 복제
한다.
YACs보다 덜 복잡해서 만들기가 더 쉬워서 전체염색체
의 물리적인 지도를 만드는 경우와 같이 거대 삽입물체
를 필요로 하는 연구에서 YAC벡터를 대신하기 시작했다.
5.4.4 Yeast artificial chromosomes(YACs)
enable cloning of megabased fragments

YAC(yeast artificial chromosome)
▶ 효모의 인위적인 염색체로서 200~500kb의 외래DNA를
삽입할 수 있다.
▶ YAC 클로닝 벡터는 거대 DNA삽입으로 완전한 유전체를
포함하는 클론을 동정하고 특성화 하기 쉽게 되어졌다
5.4.4 Yeast artificial chromosomes(YACs)
enable cloning of megabased fragments
5.5 Cloning systems for producing single
stranded and mutagenized DNA

5.5.1 Single stranded DNA for use in DNA
sequencing is obtained using M13 or phagemid
vectors or by linear PCR amplification
▶ M13 vector
섬유형파아지의 한 예로서 원형의 단일가닥DNA로 구성되어있다.
세포내에서단일가닥DNA는 상보사슬합성의 주형역할을 하여 일반적
인 이중가닥DNA로 된다. 이 분자는 박테리아유전체 속으로 삽입되
지는 않지만 그 대신에 100개 이상의 사본체가 생길 때까지 사본된
다.
Rolling circle복제에 따라 새로운 단일가닥DNA가 생성되고 새로운
coat단백질에 포장되고 숙주세포를 죽이지 않고 세포외피를 통해
방출된다.
5.5.1 Single atranded DNA for use in DNA sequencing
is obtained using M13 or phagemid vectors or by linear
PCR amplification
▶ Phagemid vectors
Phage+Plasmid의 혼성화 벡터이다.
이는 플라스미드 복제 원점을 가짐으로써 helper phage가 없는 상
태에서는 일반적인 이중가닥 플라스미드로써 대장균에서 복제되어
진다.
파아지M13복제원점을 가짐으로써 M13 helper phage가 첨가된 이
후엔 복제 파아지 형태로 전환되고 단일가닥의 DNA가 만들어지고
파아지 코트로 포장되어 방출된다.
5.5.1 Single atranded DNA for use in DNA sequencing
is obtained using M13 or phagemid vectors or by linear
PCR amplification
5.5.2 Oligonucleotide mismatch mutagenesis
can create a predetermined single nucleotide
change in any cloned gene
5.5.3 PCR-based mutagenesis includes coupling of
desired sequences of chemical groups to a target
sequence and site-specific mutagenesis

PCR mutagenesis
5.6 Cloning systems designed to
express genes

5.6.1 large amounts of protein can be
produced by expression cloning in
bacterial cells
▶ Expression vector
적절한 유전자 조절 DNA 서열과 프로모터 DNA 서열을
가지고 있어서 세포내에서 단백질을 암호화하는 DNA 삽
입물을 효과적으로 전사시킬 수 있다. 그래서 이들 벡터
로부터 대량 합성된 mRNA는 세포 안에서 단백질로 번역
된다.
5.6.1 large amounts of protein can be produced by
expression cloning in bacterial cells
5.6.2 Phage display is a form of expression cloning in
which protein are expressed on bacterial cell surfaces

Phage display
▶
Cell surface display는 박테리아, 효모와 같은 미생물의
표면 단백질을 surface anchoring motif(표면 발현 모체)
로 사용하여 외래 단백질을 미생물 표면에 안정적으로
발현시키는 기술로서 최근에 등장한 새로운 분야이다.
▶ phage의 표면은 박테리아보다 단순하기 때문에 phage
표면에 외래 단백질을 발현시키는 연구가 먼저 진행되어
졌다.
Filamentous phage의 ssDNA를 이용하여 coat 단백질
에 외부 단백질을 연결시켜 host bacteria 내에서 표현하
고, helper phage의 replication system과 부족한 phage
coat 단백질을 이용해 packaging되면서 외부 단백질을
phage surface 표현할 수 있다.
5.6.2 Phage display is a form of expression cloning in
which protein are expressed on bacterial cell surfaces
5.6.3 Eukaryotic gene expression is carried out
with greater fidelity in eukaryotic cell line
▶ Transdution
숙주세포 형질의 유전적 형질이 박테리오 파지
의 중개로 하나의 세포에서 다른 세포로 옮겨가
는 것을 말합니다.
▶ Transfection
DNA를 culture 중인 cell 내로 유입시켜 외부
DNA가 세포 내에서 발현되도록 하는 것
5.6.3 Eukaryotic gene expression is carried out
with greater fidelity in eukaryotic cell line
Cell에 expression vector를 삽입했을 경우에

Stable expression
vector가 genome에 integration 되어 expression을 하게
되는 경우

Transient expression
genome에 integration 되지 않고 episome등으로 존재
하게 되는 경우
5.6.3 Eukaryotic gene expression is carried out
with greater fidelity in eukaryotic cell line
5.6.3 Eukaryotic gene expression is carried out
with greater fidelity in eukaryotic cell line
5.6.3 Eukaryotic gene expression is carried out
with greater fidelity in eukaryotic cell line