Transcript 제한효소란?
제한효소(Restriction enzyme) 제한효소란? # Nuclease(핵산분해효소)는 DNA를 자르는 모든 효소를 말하고 뉴클레오티드 간에 phosphodiester 결합을 끊을 때 DNA 사슬 바깥쪽에서부터 자르는가 또는 안쪽을 자 르느냐에 따라 각각 exonuclease와 endonuclease로 나뉜다. Endonuclease의 대표 적인 것이 제한효소인데 DNA의 특정한 염기서열을 인식하고 인식한 서열 부위 또는 그 근처를 절단한다. # 제한효소는 원래 세균이 자신의 세포 내로 침입해 들어온 바이러스와 같은 외부 DNA 를 제거하기 위한 방어기전에서 발견되어 바이러스의 증식을 제한한다는 의미로 이름 지어 졌다. 이때 자신의 DNA에 있는 절단부위의 염기를 methylation시켜서 자신의 제 한효소가 자신의 DNA를 자를 수 없게 보호한다. Methylation # DNA methylase 유전자를 갖고 있는 숙주균으로부터 추출한 DNA는 염기 일부가 메틸(methyl)화 되어 있어서 그 부분을 인식 하는 제한효소가 절단하지 못한다. - dam methylation 예)그림 1 - dcm methylation # 숙주균 중에 DNA methylase 를 못 만드는 dam- 균주(dcm- 균주) 를 사용하는 방법으로 해결할 수 있다. 그림 1 # 제한효소는 typeⅠ, Ⅱ 분류한다. TypeⅠ은 특정 서열을 인식하지만 인식부위가 아닌 다 른 곳을 자르고, typeⅡ는 인식한 서열부위 내부를 자른다. 유전공학에서 이용하는 제한효 소는 typeⅡ다. typeⅡ 제한효소가 DNA 두 가닥을 자를 때 다음 두 가지 단편이 만들어진 다. 1. Blunt end 2. Sticky end(또는 cohesive end) STAR activity # 제한효소 중에는 특정 반응 조건 하에서 사용하면 본래의 인식서열과 다른 염기서열을 절단하는 STAR 활성이 있다. 이런 STAR활성을 억제하기 위해서는 아래의 상태에서 실험하는 것이 좋다. - 낮은 글리세린 농도 - 중성 pH - 높은 염 농도 예시) Conditions of low ionic strength, high enzyme concentration, glycerol concentration > 5%, or pH > 8.0 may result in star activity 회문구조(palindrome) # 제한효소가 인식하는 서열은 회문구조로 되어 있다. 회문구조는 원래의 서열을 뒤집은 것이 그것의 상보적 서열이 되는 것을 말한다. 예를 들어 서열 GGATCC의 상보적 서열 은 CCTAGG인데 이것은 GGATCC를 뒤집은 것과 같다. # 수학적인 설명을 덧붙이자면 회문구조를 가지기 위해선 짝수 개의 염기쌍을 가지고 있어 야 하며 가운데를 중심으로 양쪽이 상보되는 염기쌍으로 대칭을 이루어야 한다. 제한효소 관련 유용한 자료 # Isoschizomers # Compatible end http://www.neb.com/ 실험: 제한효소반응 (1) 주 재료 - 제한효소(EcoRІ) - 제한효소(BamH І) - 제한효소(Hind Ⅲ) - 10Xbuffer # 2 - BSA (For BamH І) - 빈 플라즈미드 벡터(pcDNA 6B) & 유전자가 삽입된 플라즈미드 벡터(pcDNA 6B EGFP-EcR) - 37°C 항온수조 (2)재료 및 장비 - 아가로스 - 10x TAE buffer - Ethidium bromide Stock 10mg/ml - 100ml 삼각플라스크 - 전자레인지(방열장갑 착용) - 파이펫, tip - Gel loading buffer(6X) - DNA Size marker - 전기영동장치 - UV transiluminator (2) 실험방법 1. 0.8% 아가로스 겔 만들기 2. 제한효소 처리 ① 1-2μg 플라즈미드 벡터 DNA(pcDNA 6B, pcDNA 6B EGFP-EcR)에 제한효소를 처리한 다. 효소 원액은 글리세롤이 들어있기 때문에 점도가 높아서 pipetting할 때 tip끝만 살짝 담근 후 따내야 한다. 효소량이 반응 총액의 10%를 넘으면 효소활성이 글리세롤 때문에 억제될 수 있기 때문에 주의해야 한다. Sample이 여러 개일 경우 master mixture를 만들 어 사용한다. -10Xbuffer #2 - - - - - - - - - - 2µl -100XBSA - - - - - - - - 0.2µl -plasmid vector DNA(1-2µg) - - - 10µl -Enzyme (BamH І) - - - - - 1µl (20nuits) -dH2O(DNase free) - - - - - - - 6.8µl total (반응총액) - - - - - - - - - 20µl # 1unit: One unit is defined as the amount of enzyme required to digest 1 µg of λ DNA in 1 hour at 37°C in a total reaction volume of 50 µl. ② 37℃ 항온수조에서 10분간 반응시킨다. 3. 전기영동 ③ 처리군(제한 효소를 처리한 벡터)과 비교군(효소를 처리하지 않은 벡터)을 나란히 loading한 후 100V로 전개한다. ④ 겔의 2/3 정도에 bromophenol blue가 오면 멈추고 겔을 uv-transilluminator로 관찰한 다. Hin dIII (903) Kpn I (91 3) BamHI (921 ) pcDNA 6B 5130 bp EcoRI (944) NotI (97 1 ) Hin dIII (903) Xho I (97 7 ) Kpn I (91 3) XbaI (983) BamHI (921 ) SacII (996) EcoRI (944) NotI (97 1 ) Xho I (1 7 33) pcDNA 6B EGFP-EcR 7724 bp Hin dIII (1 7 42) EcoRI (1 7 49) Xho I (2083) EGFP-EcR Kpn I (2844) Xho I (3286) SacII (3590) BamHI (3398) Xho I (3496) Kpn I (3587 )