Transcript 유전자 조작과 분석기술 2 (제한효소, Cloning, DNA marker)

강의자료-4
유전자 조작과 분석기술 2
(제한효소, Cloning, DNA marker)
제한효소
1. Stewart Linn과 Werner Arber가 1960년대말 대장균(E. coli)에서
처음으로 제한효소를 발견
2. 대장균 내에서 이 제한효소는 virus DNA같은 외래 DNA의 침입을 조각
조각으로 잘라내는 역할
3. 제한효소는 크게 endonuclease (endo=within)와 exonuclease (exo=
outside)로 나눔
4. RE들의 이름은 그 RE가 만들어지는 미생물체의 라틴어 학명으로부터 유래
예)
Hind II는 Haemophilus influenzae strain R-d에서 두 번째(II)로 발견된 RE
EcoR I 및 EcoR V는 E. coli(대장균) strain R에서 첫 번째(I)와 다섯 번째(V)
발견된 RE
5. 각 RE는 특정인식 부위를 갖음
예)
Alu I 같은 경우 AG↓CT인 4 염기를 인지하고 EcoR I은 G↓AATTC인 6 염기를,
Not I은 GC↓GGCCGC인 8 염기를 인지
► 제한효소의 인지염기서열과 절단부위
제한효소
인지염기서열
절단형태
EcoR Ⅰ
5'-G↓AATTC-3'
5'-phosphate extension
BsmH Ⅰ
5'-G↓GATCC-3'
5'-phosphate extension
Pst Ⅰ
5'-CTGCA↓G-3'
5'-phosphate extension
Sau 3AⅠ
5'-↓GATC-3'
5'-phosphate extension
Pvu Ⅱ
5'-CAG↓CTG-3'
Blunt end
Hpa Ⅰ
5'-GTT↓AAC-3'
Blunt end
Hae Ⅲ
5'-GG↓CC-3'
Blunt end
6. DNA 염기서열중 Alu I은 44 = 256 염기마다 한번씩, EcoR I은 46 = 4,096
염기마다 한번씩, Not I은 48 = 약 65,000 염기마다 한번씩 자를 수 있음
7. isoschizomer (iso=equal; schizo=split)
절단부위가 다를 뿐 염기인식부위 (restriction site)는 서로 같은 경우.
예) Sma I과 Xma I
8. 제한효소가 자른 두 DNA 단편은 sticky ends들을 갖게 되는데 주로 이
sticky ends를 이용하여 다른 DNA와 연결시키는데 사용
예) EcoR I
5'----GAATTC----3‘
----G-3'
3'----CTTAAG----5'
----CTTAA-5'
5'-AATTC----
3'-G----
9. 제한효소의 유전공학으로의 이용
1) 외래 DNA 단편의 vector내로의 cloning
cDNA library
Genomic DNA library
2) 개체의 DNA 지문 검색 (fingerprinting)
SNP (single-nucleotide polymorphism),
RFLP (restriction fragment length polymorphism),
AFLP (amplified fragment length polymorphism)와 같은 탐색
<DNA 단편의 cloning>
<RFLP의 예>
유전자의 cloning 이란 ?
1. 특정한 DNA 단편을 제한효소를 사용하여 벡터(vector) DNA에 결합
하여 숙주세포에 도입시켜 그 DNA 단편을 증폭시키는 조작
2. 유전자 클로닝이 사용되는 이유
한정된 양의 DNA 출발물질로부터 다수의 재조합 DNA 분자가 만들어
진다.
형질전환-박테리아 세포로 DNA 도입
Plasmid 벡터의 조건
1) 복제의 시작점(origin)을 갖고 있음
2) 대장균 내에서의 선발 표지인자를 갖고 있음
주로 항생제 저항성 인자 (ampr, tetr)
lacZ를 이용한 발색 반응
3) 벡터 DNA 염기서열 내에 다양하며 유일한 제한효소 인지부위를 갖음
<pBR322 plasmid 벡터>
▣ DNA maker의 종류
▶ Simple sequence length polymorphism(SSLP)
초위성체(microsatellite, MS)마커 또는 STRs(short tandem repeats)라고도
불리며, Weber(1990) 등에 의해서 DNA marker로 도입되었다. 대부분의 진핵생
물체의 유전체(genome)에서 발견되는 1~6bp 크기의 단순염기서열들이
10~50회 가량 반복되는 형태를 가진 일종의 반복 DNA 부분이며, PCR기법을
이용하여 간단히 분석을 실시할 수 있다.
▶ 단일염기다형(single nucleotide polymorphism, SNP)
SNP는 돌연변이를 일으키는 화학물질 또는 DNA복제과정 중의 실수 등에 의
해서 발생하는 가장 단순한 형태의 DNA 다형성이다. 또한 일부의 SNP는 발현
되는 유전자 내에 직접 존재하여 QTL분석 등에서 가장 효율적인 DNA marker로
사용 될 수 있다.
▶ 제한효소 절편다형(restriction fragment length polymorphism, RFLP)
자연발생돌연변이에 의한 일부의 염기서열변화는 제한효소들에 의해 인지되는
제한효소인식부위를 변화시켜, 제한효소로 DNA를 절단하였을 때 DNA단편
(fragment)의 길이에 변화를 일으킨다.
► SNP의 특징
Mutation site(HhaI : GCGC)
1111 5‘-ATAAAGGCTTCATCTCGTTCAAGCACTTGTAGCTAGGTTTAATCATCATCA-3’
2222 5‘-ATAAAGGCTTCATCTCGTTCAAGCGCTTGTAGCTAGGTTTAATCATCATCA-3’
3333 5‘-ATAAAGGCTTCATCTCGTTCAAGGACTTGTAGCTAGGTTTAATCATCATCA-3’
4444 5‘-ATAAAGGCTTCATCTCGTTCAAGCGCTTGTAGCTAGGTTTAATCATCATCA-3’
5555 5‘-ATAAAGGCTTCATCTCGTTCAAGCRCTTGTAGCTAGGTTTAATCATCATCA-3’
Figure 1. 232bp의 DNA 염기서열과 그 내부에서 나타나는 점 돌연변이
► Microsatellit(MS)의 특징
◇ 마이크로세틀라이트(microsatellite; MS) 또는 STRs(short tandem repeats)
라고도 불리며,Weber(1990) 등에 의해서 도입되었음.
⇒ 국내에서는 초위성체마커로 번역되어 사용되고 있음.
◇ 2 bp의 단순염기서열들이 10~50회 가량 반복되는 형태를 갖는 특성이 있음.
◇ 유전적 다형성 분석은 반복염기의 반복횟수 차이에 따라서 반복염기의 주위로
PCR primer를 만들어 DNA를 증폭하였을 경우 동일한 primer를 사용하였으
나 반복 수 차이에 의한 PCR 산물의 크기 차이를 자동염기서열분석 장치를
이용 분석하여 개체별 MS marker들의 다형성을 파악함.
(A)
(B)
DNA marker
Forward Primer
Figure 2. ILSTS 013 DNA marker의 염기서열 및 염색체 위치
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search)
Reverse Primer
▣ 개체별 반복염기서열 수의 차이