Transcript Brock Biology of Microorganisms

Chapter 11. Studying gene
expression and function
• 유전자 발현의 기본원리
• 전자현미경을 이용한 핵산
분자의 분석
- 핵산 분자의 지름을 증가 ;
화학물질 처리
- Cytochrome C ;
polynucleotide에 결합
- Electro-dense ; Acetate 처리
- 염색
- 핵산 관찰
• 유전자의 전사체에 대한 연구
1. 전자 현미경상으로 관찰시 나타나는 DNA-RNA 혼성체
- Intron의 수 와 위치를 결정
2. 핵산분해효소의 처리를 통한
DNA-RNA 융합체 분석
- S1 nuclease ;
단일 가닥 사슬의 핵산에만
반응하는 핵산 분해효소
- Alkali 처리 ;
RNA 분해
3. Primer extension
- RNA의 5’ 말단을 확인
- Primer ;
염기서열 일부분을 알아야 함
- Reverse transcriptase
• RNA 전사체 연구를 위한
기타 방법들
1. Northern hybridization
- Formaldehyde gel ;
- 변성화
- 분자간 또는 분자내에서
- 염기쌍을 이루는 것을
막아줌
- 포유류의 ribosomal RNA ;
4718bp & 1874bp
2. 역전사 PCR (RT-PCR)
- Reverse transcriptase
- Taq. Polymerase
- 유전자의 발현 양상 조사
- RACE ;
- Rapid amplification of
cDNA ends
- RNA 분자의 5’ 과 3’ 말단을
확인
• 유전자 발현의 조절에 관한 연구
- 조절 단백질 (조절 부위)
• DNA 분자상의 단백질 결합부위 결정
1. DNA-protein 복합체의 gel retardation
- 분자량이 증가 ; 낮은 이동성
- 조절부위 ; 10bp 미만
• Gel retardation experiment
2. Footprinting with DNase I
- 조절 단백질이 DNA 상에 결합함으로써 조절부위가 Dnase I과 같은
Endonuclease에 의해 분해되지 않는다는 원리
• DNase I footprinting
- 각 DNA 단편 한 쪽 말단에 방사성
동위원소로 표지
- 조절 단백질 첨가
- DNA 조각이 완전히 분해되지 않을 정도의
DNase I 첨가
- Phosphodiester bond을 절단
3. Modification interference assays
- 조절 단백질은 조절 염기서열 보다 더 길게 DNA를 결합하고 있음.
• Modification interference assay
- End-labelling
- Dimethyl sulphate ;
Methyl groups to guanine NT
- Piperidine ;
메틸화된 NT의 DNA 분자를 절단
• Deletion analysis를 이용한 조절부위의 동정
• Reporter gene
- 숙주세포에서 발현되지 않는 표현형
- 검정하기가 용이
- 정량적으로 분석 가능
• Deletion analysis
- 유전자 발현 양상
- 조직 특이성 변화
- 발생과 분화에 대한 유전학적 분석
• HRT ;
Hybrid-release translation
• HART ;
Hybrid-arrest translation
- 유전자에 의해 합성되는 단백질을 동정
- 씨앗 또는 토끼의 reticulocyte 추출물
- 35S-methionine + 19 amino acid
• HRT ;
Hybrid-release translation
-
Specific cDNA
변성
Nitrocellulose or nylon membrane
mRNA sample
Hybridized mRNA
Translation
• Hybrid-arrest translation
- mRNA + single strand cDNA
- Translation
• Analysis of proteins by
in vitro mutagenesis
• 돌연변이 기법
1. 제한효소 단편에서의 결실
2. 제한효소 인식부위에서의
NT 제거 ;
- Endonuclease, Bal31
3. Oligonucleotide 삽입 ;
- 불안정화
- -helix (새로운 구조)
• Oligonucleotide-directed mutagenesis
(point mutation)
- Single-stranded DNA ; M13 vector
- Double-stranded DNA ;
- Short primer (oligonucleotide)
- Klenow fragment
- dNTPs
- Transfection into E. coli
- Semi-conservative nature of
DNA replication
• 단백질과 단백질의
상호작용에 관한 연구
1. Phage display
- Phage display library
- Microtitre well or
Chromatography column
• 단백질과 단백질의 상호작용에
관한 연구
2. Yeast two-hybrid system
- Bait vector
- Prey vector (library)