Transcript 3.ศึกษาปริมาณน้ำตาลรีดิวซ์ที่ได้จากการแช่ยุ่ยใบไม้ด้วยกรด

การศึกษางานวิจัย
อาจารย์ วิทยา เกริกศุกลวณิชย์
จัดทำโดย
นางสาวพรชิ ตา ลาคา ม.5/1 เลขที ่ 15
คานา
โลกได้ มีความก้ าวหน้ าอย่างรวดเร็ ว ก่อให้ เกิดเทคโนโลยีองค์
ความรู้ใหม่ๆเพื่อตอบสนองต่อความต้ องการมนุษย์ เเนื่องจากแหล่ง
พลังงานธรรมชาติที่มนุษย์นามาใช้ จนมีปริ มาณลดลงอย่างต่อเนื่องนัน้ จึง
สนใจถึงการศึกษางานวิจยั ในเรื่ องของพลังงานทดแทน เป็ นทางเลือก
หนึง่ ของปั ญหานี ้ได้ โดยโครงการงานวิจยั ที่ข้าพเจ้ าเลือกศึกษา คือ
งานวิจยั เรื่ อง เทคโนโลยีกำรหมักเพื่อผลิตเอทำนอลจำก
อินทรี ย์ใบไม้ ของสถาบันวิจยั วิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี
มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ ซึง่ ผู้ช่วยศาสตร์ จารย์ ดร.นฤมล ทองไว เป็ น
หัวหน้ าโครงการ
สารบัญ
บทคัดย่ อ
บทที่ 1 ความสาคัญและที่มา
ของปั ญหาที่ทาการวิจยั
บทที่ 4 ผลการวิจยั และ
อภิปราย
บทที่ 3 วิธีการวิจยั
บทที่ 5 สรุปผลการวิจยั
บทคัดย่ อ
แหล่งพลังงานธรรมชาติในปัจจุบนั มีปริ มาณลดลง พลังงานทดแทนจึงเข้ามามีบทบาท
โดยเฉพาะเอทานอลที่ใช้เป็ นส่ วนผสมของน้ ามันเชื่อเพลิง จึงได้ทาการวิจยั เพื่อศึกษาวิธีการผลิต
เอทานอลโดยอาศัยกระบวนการหมักของจุลินทรี ย ์ โดยเลือกใช้ใบสักแห้งเป็ นสารตั้งต้น โดยนา
crude enzyme จาก Bacillus sp. CM12 มาย่อยเซลลูโลสในใบไม้ให้เป็ นน้ าตาลรี ดิวซ์ พบว่า การ
ย่อยจะให้น้ าตาลรี ดิวซ์สูงสุ ด 6174.56 + 1068 ug/mlจากนั้นทาการแช่ยยุ่ ใบไม้ดว้ ยกรดแลกติก
กรดไนตริ ก กรดซัลฟูริก และกรดไฮโดรคลอริ ก เพื่อเพิ่มปริ มาณน้ าตาลรี ดิวซ์ พบว่า กรดแลกติ
กย่อยเซลลูโลสให้เป็ นน้ าตาลรี ดิวซ์ได้มากที่สุด เมื่อเพาะเลี้ยง Bacillus sp. CM12 ลงไปใน Leaf
medium ที่ผา่ นการแช่ยยุ่ ด้วยกรด พบว่า มีการย่อยเซลลูโลสให้เป็ นน้ าตาลรี ดิวซ์ได้เล็กน้อย เอ
ทานอล ด้วยการเติมเชื้อ Saccharomyces cerevisiae อย่างไรก็ตามพบว่า การใช้ใบสักแห้งเป็ น
สารตั้งต้นให้ปริ มาณเอทานอลค่อนข้างต่า การพัฒนากระบวนการผลิตจึงเป็ นสิ่ งจาเป็ น
•
บทที่ 1 ความสาคัญและที่มาของปั ญหาที่ทาการวิจยั
โลกกาลังประสบปั ญหาการขาดแคลนพลังงานเชื้อเพลิง การค้นหาแหล่งพลังงาน
ทดแทน ซึ่งได้มาจากพลังงานชีวมวล จึงมีความสาคัญ เนื่องจากสามารถเพาะเลี้ยงได้ง่ายมี
ช่วงชีวติ สั้น ปั ญหาที่ตามมา คือ การขาดแคลนวัตถุดิบทางการเกษตร ทางเลือกหนึ่งของการ
แก้ปัญหานี้ได้แก่ การนา“เศษซากอินทรี ยจ์ ากพืช” ซึ่งมีปริ มาณของเซลลูโลสสูง มาใช้เป็ น
แหล่งวัตถุดิบแทนพืชผลทางการเกษตร หรื อใช้เศษซากที่เหลือทิ้งจากการเก็บเกี่ยวผลผลิต
การเกษตร มาแปรรู ปนาจุลินทรี ยท์ ี่สามารถย่อยสลายอินทรี ยใ์ บไม้ได้มาเพาะเลี้ยงร่ วมกับ
จุลินทรี ยท์ ี่สามารถผลิตเอทานอล จะทาให้ได้ผลผลิตสุ ดท้ายเป็ นเอทานอลที่สามารถนาไปใช้
เป็ นเชื้อเพลิงได้
บทที่ 3 วิธีการวิจยั
1.จุลนิ ทรีย์ทใี่ ช้
2.การศึกษาการผลิตนา้ ตาลรีดวิ ซ์ จากใบสั กแห้ งโดยแบคทีเรีย Bacillus sp. CM12
3.ศึกษาปริมาณนา้ ตาลรีดิวซ์ ทไี่ ด้ จากการแช่ ย่ ยุ ใบไม้ ด้วยกรด
4.ศึกษาการผลิตนา้ ตาลรีดวิ ซ์ จากการแช่ ย่ ยุ ใบไม้ ด้วยกรด ร่ วมกับการหมักด้ วย
แบคทีเรียทีย่ ่ อยสลายเซลลูโลสได้
5.การศึกษาการผลิตเอทานอลโดยยีสต์ Sacharomycescerevisiae
• Bacillus sp. CM12 (ศศิธร, 2552) ที่มีความสามารถในการ
ย่อยใบไม้ได้ดี
• Saccharomyces cerevisiae ที่มีความสามารถในการผลิตเอ
ทานอล
2.1การผลิตน้าตาลรี ดิวซ์ โดยใช้ เซลล์ อัดแน่ น ของ Baillus sp. CM12 และ
crude extracellular enzyme จาก Bacillus sp. CM12
•
•
•
•
การเพาะเลี้ยง Bacillus sp. CM12 ในอาหาร แล้วนาไปบ่ม
ปั่นเหวีย่ ง จากนั้นเก็บส่ วนใส แยกจากเซลล์ไว้ใน freezer เก็บเซลล์อดั แน่นไว้ ชัง่ ให้ได้2g
ล้างเซลล์ 3 ครั้ง โดยเติม PBS ลงไป แล้วทาซ้ าข้อ2 จากนั้นทาเช่นนี้อีก2 รอบ
นาเซลล์อดั แน่นจากข้อ3 เพาะลงใน leaf medium นาไปบ่ม เขย่าตรวจวัดน้ าตาลรี ดิวซ์ดว้ ยวิธี
DNS ทุก24ชัว่ โมง เป็ นเวลา 72 ชัว่ โมง
ปิ เปตส่ วนใสจากข้อ2 ลงใน leaf medium ปรับปริ มาตรเป็ น 1ml และ 2ml นาไปบ่ม เขย่า
ตรวจวัดน้ าตาลตามเดิม
2.2การผลิตน้าตาลรี ดิวซ์ โดยใช้ เศษเซลล์ อัดแน่ น ของ Bacillus sp.CM12
และ crude intracellular enzyme จาก Bacillus sp. CM12
•
•
•
•
•
•
•
เพาะเลี้ยง Bacillus sp. CM12 ลงในอาหาร นาไปบ่ม
ปั่นเหวีย่ งนาน10นาที ริ นส่ วนใสออก เก็บเซลล์อดั แน่นไว้
ล้างเซลล์3ครั้ง โดยการเติม PBS ลงไป แล้วทาเหมือนข้อ2 จากนั้นทาเฃ่นนี้อีก2รอบ
เมื่อได้เซลล์อดั แน่นครั้งสุ ดท้าย ให้เติม PBS ลงไปเป็ นเวลา15นาที
นาไปปั่นเหวีย่ ง นาน 10 นาที แยกส่ วนใสไว้ในfreezer ริ นส่ วนใสที่เหลือออก เก็บเศษเซลล์อดั แน่นไว้
นาเศษเซลล์อดั แน่นจากข้อ 5 ใส่ ลงใน leaf medium นาไปบ่ม เขย่าตรวจวัดน้ าตาลรี ดิวซ์ดว้ ยวิธีเดิม
ปิ เปตส่ วนใสจากข้อ5ใส่ ลงใน leaf medium นาไปบ่ม เขย่า แล้วตรวจวัดน้ าตาลรี ดิวซ์ดว้ ยวิธีเดิม
• 1.เตรี ยมาสารละลายกรดแลกติก กรดไนตริ ก กรดซัลฟูริก และกรด
ไฮโดรคลอริ ก ที่ความเข้มข้นต่างๆอย่างละ 100 ml ในขวดแบนปริ มาตร
250 ml
• 2.เติมใบสัก ที่ผา่ นการอบแห้ง15 g ลงในสารละลายแต่ละความเข้มข้น
ตั้งทิ้งไว้ที่อุณหภูมิหอ้ ง ตรวจวัดน้ าตาลรี ดิวซ์ดว้ ยวิธี DNS ทุก24 ชัว่ มาง
เป็ นเวลา 72 ชัว่ โมง
• 1.แช่ยยุ่ ใบไม้ดว้ ยกรดแลกติกที่ความเข้มข้น 1%(v/v) 100 ml ปรับ pH ให้เป็ น 7.0 เติม yeast
extreact 0.5 g นาไปฆ่าเชื้อด้วยการ autoclave ปล่อยให้เย็นลง
• 2.ถ่ายเชื้อแบคทีเรี ย Bacillus sp. CM12 ลงในขวดอาหารที่เตรี ยมไว้ในข้อ1 นาไปบ่มที่45
องศาเซลเซี ยส เขย่า ตรวจวัดน้ าตาลรี ดิวซ์ดว้ ยวิธี DNS ทุก24ชัว่ โมงเป็ นเวลา 72 ชัว่ โมง
• 3.ถ่ายเชื้อยีสต์ Saccharomyces cerevisiaeลงในขวดอาหารที่เตรี ยมไว้ในข้อ 4.1 นาไปบ่มที่
30 องศาเซลเซี ยส เขย่า ตรวจวัดปริ มาณน้ าตาลรี ดิวซ์ดว้ ยวิธีเดิม
1.เตรี ยม leaf medium โดยมีใบสักอับแห้งปริ มาณ 75 g ปริ มาตร 500 ml ในขวดรู ปชมพูข่ นาด 1000 ml
2.เพาะเลี้ยง Bacillus sp. CM12 ลงในอาหาร บ่ม
3. ปั่ นเหวี่ยง ปิ เปตส่ วนใส 5ml (1%v/v) ใส่ ลงใน leaf medium ในข้อ1 นาไป เขย่า
4.เพาะเลี้ยงยีสต์ Saccharomyces cerevisiae ลงในอาหาร YM broth นาไปบ่ม
5. ปั่ นเหวี่ยง ริ นส่ วนใสออก เก็บเซลล์อดั แน่นไว้
6. ล้างเซลล์ 3 ครั้ง โดยการเติม PBS ลงไป แล้วทาเหมือนข้อ 5 จากนั้นทาเช่นนี้อีก 2 รอบ
7.นาเซลล์อดั แน่นจากข้อ 3 เพาะลงในอาหารข้อที่ 1 นาไปบ่ม
8. เก็บตัวอย่างน้ าเลี้ยงเชื้อในชัว่ โมงที่ 0,24,48,72,96 และ 120 เพื่อนาไปวัดปริ มาณน้ าตาลรี ดิวซ์ดว้ ยวิธี DNS
และตรวจวัดปริ มาณเอทานอล ด้วยวิธีแก๊สโครมาโตกราฟฟี
• 9.ทาการทดลองเช่นเดียวกับข้างต้น โดยเปลี่ยนน้ าหนักเซลล์อดั แน่นของ Saccharomyces cerevisiae เป็ น
10g (2% w/v)
•
•
•
•
•
•
•
•
บทที่ 4 ผลการวิจยั และอภิปราย
• 1.การผลิตนา้ ตาลรีดวิ ซ์ จากใบสั กแห้ งโดย Bacillus sp. CM12
พบว่า 1%(v/v) crude extracellular enzyme ให้ปริ มาณน้ าตาลรี ดิวซ์ สูงสุ ดคือ 6174.56 +
348.50 ug/ml 2%(v/v) crude extracellular enzyme ให้ปริ มาณน้ าตาลรี ดิวซ์ ใกล้เคียงกันคือ
6103.04 +332.23 ug/mlโดยทั้ง2ชุดเพิม่ สูงในชัว่ โมงที่ 48 สาหรับ 2% (w/v) เศษเซลล์อดั แน่น
ของ Bacillus sp.CM12 , 2%(v/v)crude intracellular enzyme และชุดควบคุม มีปริ มาณน้ าตาล
รี ดิวซ์เฉลี่ยใกล้เคียงกัน คือ 5457.40+137.32 ug/ml ,
5336.74+207.68 ug/ml และ 5403.91+59.57 ug/ml ตามลาดับ และ เซลล์อดั แน่น ของ Bacillus
sp.CM12 ให้ปริ มาณน้ าตาลรี ดิวซ์เฉลี่ยน้อยที่สุด คือ 4170.00+1640.65 ug/ml
3.การตรวจวัดปริมาณนา้ ตาลรีดิวซ์ ทไี่ ด้ จากการแช่ ยุ่ยด้ วยกรด
พบว่า กรดแลกติกทุกความเข้มข้นให้ปริ มาณน้ าตาลรี ดิวซ์สูงที่สุด
กรดไนตริ กให้ปริ มาณน้ าตาลรี ดิวซ์สูงสุ ดที่ความเข้มข้น1.11M ใน
ชัว่ โมงที่72 , กรดซัลฟูริกให้ปริ มาณน้ าตาลสูงสุ ดที่ควมเข้มข้น 0.94 M
ในชัว่ โมงที่72 , กรดไฮโดรคลอริ กให้ปริ มาณน้ าตาลูงสุ ดที่ความ
เข้มข้น 0.32 M ในชัว่ โมงที่72 โดยมีปริ มาณน้ าตาลรี ดิวซ์ 1768.69+7.38
ug/ml ,2066.09+14.76 ug/ml และ 1742 .61+73.79 ug/ml ตามลาดับ
4.ปริมาณนา้ ตาลรีดิวซ์ จากการแช่ ยุ่ยใบไม้ ด้วยกรด ร่ วมกับการหมัก
ด้ วยแบคทีเรียทีย่ ่ อยสลายเซลลูโลสได้
พบว่า Bacillus sp. CM12 ใน leaf medium ให้ปริ มาณน้ าตาล
รี ดิวซ์สูงสุ ดในชัว่ โมงที่24 โดยมีปริ มาณน้ าตาลรี ดิวซ์
4278.26+47.96 ug/ml ซึ่งสูงกว่าชุดควบคุมเล็กน้อย สาหรับปริ มาณ
น้ าตาลรี ดิวซ์จากการเพาะเลี้ยง Saccharomyces cerevisiae ใน leaf
medium พบว่า ปริ มาณน้ าตาลรี ดิวซ์เริ่ มลดลงในชัว่ โมงที่24 และ
เมื่อบ่มต่อไป พบว่าปริ มาณน้ าตาลรี ดิวซ์ในอาหารลดต่าลงอย่าง
ต่อเนื่อง
5.การผลิตเอทานอลโดยยีสต์ Sacharomyces cerevisiae
พบว่า การหมักโดยใช้เซลล์อดั แน่น 1%(w/v) และ 2%(w/v)
ของ Saccharomyces cerevisiae มีเอทานอลสูงสุ ดปริ มาณ
0.75%(v/v)และ 0.74%(v/v) ตามลาดับ ในชัว่ โมงที่24ของการ
หมัก และการหมักในระดับ 5L โดยใช้เซลล์อดั แน่น 1% (w/v)
ของ Saccharomyces cerevisiae มีเอทานอลสูงสุ ดปริ มาณ
0.86%(v/v) ในชัว่ โมงที่24 ของการหมักเช่นกัน เมื่อตรวจวัด
ปริ มาณน้ าตาลรี ดิวซ์ พบว่าปริ มาณน้ าตาลรี ดิวซ์ลดต่าลงตั้งแต่
ชัว่ โมงที่24ของการเพาะเลี้ยง
บทที่ 5 สรุปผลการวิจยั
จากการนาcrude enzyme จาก Bacillus sp. CM12 มาย่อยเซลลูโลสในใบไม้ให้เป็ น
น้ าตาลรี ดิวซ์ พบว่า การย่ อยเซลลูโลสด้ วย crude enzymeให้ น้าตาลรีดวิ ซ์ สูงสุ ด
6174.56+1068 ug/ml จากนั้นทาการแช่ยยุ่ ใบไม้ดว้ ยกรด เพื่อเพิ่มปริ มาณน้ าตาลรี ดิวซ์ พบว่า
กรดแลกติกย่ อยเซลลูโลสให้ เป็ นน้าตาลรีดวิ ซ์ ได้ มากที่สุด เมื่อเพาะเลี้ยง Bacillus sp.CM12
ลงไปใน leaf medium ที่ผา่ นการแช่ยยุ่ ด้วยกรด พบว่า มีการย่อยเซลลูโลสให้เป็ นน้ าตาล
รี ดิวซ์ได้เล็กน้อย และเมื่อทาการหมักด้วยการเติมเชื้อ Saccharomyces cerevisiae เพื่อเปลี่ยน
น้ าตาลรี ดิวซ์ให้เป็ นเอทานอล พบว่าการหมักโดยใช้ น้าหนักเซลล์ อดั แน่ น1%(w/v) และ
2%(w/v) ให้ เอทานอลสู งสุ ด 0.75%(v/v) และ 0.74%(v/v) ตามลาดับ ในชัว่ โมงที่24 ของการ
หมัก อย่างไรก็ตามพบว่า การใช้ใบสักแห้งเป็ นสารตั้งต้นให้ปริ มาณเอทานอลค่อนข้างต่า
การพัฒนากระบวนการผลิตจึงเป็ นสิ่ งจาเป็ น