Transcript Mycoplasma pneumoniae - prezentácia
Slide 1
Mycoplasma pneumoniae
ŠZÚ Banská Bystrica (www.szubb.sk)
NRC pre M. pneumoniae
RNDr. Renáta Kissová
Slide 2
Synonymá a najpoužívanejšie
výrazy
•
•
•
•
•
•
PPLO
pleuropneumonia like organism
mykoplazmová pneumónia
PAP
primárna atypická pneumónia
mykoplasma (mykes-huba, plasmaforma,tvar)
Slide 3
História
• 1898 Nocard a Roux izolovali prvú
mykoplazmu (dnes Mycoplasma mycoides)
• 30-te roky prvé izolácie u človeka,
označované ako PPLO
• 1944 Eaton a spol. izolácia zo spúta
chorých na atypickú pneumóniu, Eatonovo
agens - vírus
Slide 4
História
• 1957 Liu a spol.- metódy sérologického
dôkazu
• 1961 Hayflick izoloval prvýkrát patogéna
na pevnom agare, splnené Kochove
postuláty
• 1963 zaradená medzi baktérie a
pomenovaná Mycoplasma pneumoniae
Slide 5
Fylogenéza
• „degeneratívna evolúcia“ od baktérií s
bunkovou stenou, od grampozitívnych
baktérií druhov Clostridium, Lactobacillus,
Bacillus a Streptococcus
• redukciou genómu a stratou funkcií
potrebných pre syntézu bunkovej steny
Slide 6
Taxonómia
•
•
•
•
•
•
•
Ríša
Oddiel
Trieda
Rad
Čeľaď
Rod
Druh
•
•
•
•
•
•
•
Prokaryotae
Tenericutes
Mollicutes
Mycoplasmatales
Mycoplasmataceae
Mycoplasma
M. pneumoniae
Slide 7
Genóm
• úplná sekvencia genómu
(Himmelreich,1996)
• cirkulárna dvojitá DNA s 816,394 bp
• kódujúce oblasti tvoria 88,7% genómu
• najviac príbuzné k sekvenciám B. subtilis
(vývojová príbuznosť s vetvou
Lactobacillus-Clostridium)
Slide 8
Charakteristika
• pleomorfné mikroorganizmy bez BS
• 100-300 nm - veľkosť poxvírusov
• najmenšie a najjednoduchšie prokaryonty
schopné samostatného rastu a
rozmnožovania (kultivácia na umelých
živných pôdach)
• cytoplazmatická membrána s cholesterolom
(ako u eukaryotických buniek)
Slide 9
Slide 10
Replikačný cyklus
• základný útvarelementárne teliesko
• binárne delenie
• delenie cytoplazmy sa
môže opozďovať za
replikáciou genómumnohojadrové vlákna,
neskôr retiazka
kokovitých útvarov
Slide 11
Epidemiológia
• rozšírené celosvetovo
• vyvolávajú asi 20% pneumónií
( v uzavretých kolektívoch až do 50% )
• častejšie na jeseň a v zime, v miernom
podnebí
• častejšie u malých detí (u starších
reinfekcie)
• u 3-10% infikovaných postihnutie pľúc
Slide 12
Epidemiológia
•
•
•
•
Hostiteľ - len človek, ojedinele primáty
Infekčná dávka - zatiaľ neznáma
Rezervoár - človek
Inkubačná doba - 6-23 dní, zrejme súvisí s
veľkosťou infekčnej dávky
• Infekciozita - osoba je infekčná asi týždeň
po ochorení, najmenej 10 dní
Slide 13
Spôsob prenosu
• kvapôčkovou nákazou
• pomalé šírenie ovplyvňujú 3 faktory:
- nízka infekčnosť pôvodcu
- nízka manifestnosť nákazy
- relatívne dlhá inkubačná doba
• prenos infekcie vyžaduje úzky a dlhodobejší
kontakt, hlavne v komunitách
Slide 14
Virulencia
• spojená s membránovými proteínmi
naviazanými na lipidoch na bunkovom
povrchu
• adhezíny umožňujú mykoplazme
kolonizovať mukózne membrány a povrchy
• sekvencie adhezínov M. pneumoniae nesú
významnú homológiu k štrukturálnym
proteínom cicavcov – poruchy imunity
Slide 15
Virulencia
• tvorba hydrogén peroxidov a
superoxidových radikálov
• kompetícia alebo deplécia živín a
biosyntetických prekurzorov
• prítomnosť púzdru podobnému materiálu
• antigénna variácia
• sekrécia mykoplazmatických enzýmov
• intracelulárna prítomnosť
Slide 16
Imunológia
• dosiaľ nie je úplne objasnená
• tvorba antilipidových protilátok viažúcich
komplement – nezabraňujú možným
reinfekciám, sú len odrazom
predchádzajúcej infekcie
• špecifické IgM protilátky pretrvávajú do
5 mesiacov po infekcii, nemusia sa objaviť
pri reinfekcii
Slide 17
Imunológia
• uplatňuje sa tiež imunita sprostredkovaná
bunkami
• rezistencia k infekcii je výsledkom
komplexného pôsobenia rady imunitných
pochodov
• pri prvom kontakte s infekciou dochádza k
senzibilizácii organizmu, pri ďalšom
kontakte plne rozvinuté ochorenie
Slide 18
Patogenéza
• doposiaľ nie je úplne preskúmaná
• patogenetický účinok je vyvolaný dvoma
mechanizmami:
- účinok toxických substancií
produkovaných mikroorganizmom
- účasť hostiteľskej imunitnej odpovede
Slide 19
Klinické príznaky
• Pľúcne manifestácie
- typický je ľahký, spontánne sa hojaci
respiračný infekt
- pozvoľný začiatok, teplota, únava, kašeľ,
bolesti hlavy a svalov
- faryngitída, tracheobronchitída, bronchitída
- zriedka konjunktivitída, otitída, sínusitída,
syndróm dychovej tiesne
Slide 20
Klinické príznaky
- počet leukocytov normálny, niekedy
eozinofília, vysoká sedimentácia
- slabé auskultačné nálezy
- u 3-10% osôb rozvoj pneumónie
- zväčša mierny priebeh, atypická pneumónia
- bežné sú subklinické infekcie
- u osôb s imunodeficitom je veľké riziko
pľúcnych komplikácií
Slide 21
Klinické príznaky
• Mimopľúcne
maniestácie
- veľmi pestré, môžu
postihnúť každý orgán
- objavujú sa 1-23 dní
po začiatku
respiračných potiaží,
- aj bez respiračného
ochorenia
Slide 22
Klinické príznaky
• Neurologické komplikácie
(meningoencefalitída, aseptická
meningitída, vzostupná paralýza, GBS, atď)
- u niektorých pacientov trvalé postihnutie v
podobe chabých obŕn, para- a hemiplégie,
afázie
- izolácia M. pneumoniae z likvoru sa
podarila len v ojedinelých prípadoch
Slide 23
Klinické príznaky
• Hematologické komplikácie
- U 33-76% sa objavia chladové aglutiníny,
následkom čoho vzniká hemolytická anémia
s pozitívnym Coombsovým testom,
2-3 týždne od začiatku ochorenia
- Raynaudova choroba, útlm kostnej drene,
hemoglobinúria, trombocytopénia,
diseminovaná intravaskulárna koagulácia
Slide 24
Klinické príznaky
• Dermatologické komplikácie
- zmeny na koži a slizniciach obvykle
2 týždne od začiatku ARO
- exantém – klinicky nezávažné
- erythema multiforme major,
- Stevens-Johnsonov syndróm
Slide 25
Klinické príznaky
•
•
-
Kardiologické komplikácie
postihnutie myokardu u 4,5% infikovaných
perikarditída, myokarditída, kompletný blok
Gastrointestinálne a renálne komplikácie
nešpecifické (strata chuti do jedla, zvracanie,
hnačka)
• Rôzne
- bolesti svalov a kĺbov
Slide 26
Citlivosť na antibiotiká
•
•
-
Lieky voľby:
Tetracyklíny ( doxycyklín )
Makrolidy ( erytromycín, azitromycín )
Citlivé aj na:
Aminoglykozidy ( gentamycín )
Linkozamíny ( klindamycín )
Fluorochinolóny ( trovafloxacín )
Slide 27
Citlivosť na antibiotiká
Terapia by mala trvať 10-14 dní
• Rezistencia na antibiotiká:
- prirodzene rezistentná na penicilíny a
cefalosporíny
- rezistencia na rifampicín a trimethoprim
- ojedinele na tetracyklín (gén tetM)
• Vakcinácia: doposiaľ sa nepodarilo
pripraviť účinnú vakcínu
Slide 28
Laboratórna diagnostika
• Kultivácia
• Mikroskopické
vyšetrenia
• Sérologické vyšetrenia
• Molekulárnobiologické vyšetrenia
Slide 29
Kultivácia M. pneumoniae
• veľmi náročná a zdĺhavá
• na pevných, tekutých a difázických pôdach
• PPLO agar a bujón (konské sérum,
kvasnicový extrakt, D-glukóza,
pH indikátor a antibiotiká)
• pri 36-37°C a atmosfére 5%CO2 a 95%N2
alebo za aeróbnych podmienok
Slide 30
Kultivácia M. pneumoniae
• trvá 7-14 dní (so subkultiváciou niekoľko
týždňov)
• kolónie na agare sú typické, vzhľadu
„volského oka“, okrúhle, čiastočne vrastené
do agaru, s priemerom 10-100 μm
• odčítava sa mikroskopicky pri zväčšení 30100 x
• vykonávajú sa najmenej 3 slepé pasáže
Slide 31
Kultivácia M. pneumoniae
• farbenie kolónií
Dienesovým farbením
• odlíšenie
pseudokolónií
(kryštály kalciových
a magnéziových solí)
zahriatím na 60°C
30min
Slide 32
Kultivácia M. pneumoniae
• Diferenciácia mykoplaziem:
- na základe rozdielnej metabolickej aktivity
(ureaplazmy metabolizujú ureu,
M. fermentans metabolizuje glukózu a arginín,
M. hominis arginín, M. genitalium
a M. pneumoniae skvasujú glukózu)
- rastovo inhibičný test – jednotlivé druhy
mykoplaziem sa dokazujú za pomoci
hyperimúnnych sér
Slide 33
Schéma vyšetrenia materiálu na
prítomnosť mykoplaziem
Biologický materiál
PPLO bujón
PPLO agar
PPLO bujón
PPLO agar
PPLO agar
pozitívny
PPLO bujón
Negatívny - ex
Negatívny - ex
pozitívny
pozitívny
Negatívny - ex
PPLO agar
identifikácia
PPLO bujón
PPLO agar
identifikácia
Slide 34
Sérologická diagnostika
• Dôkaz protilátok proti celobunkovým alebo
izolovaným mykoplazmovým antigénom:
- KFR
- ELISA
- imunofluorescenčný test
- Western-blot
• Chladový aglutinačný test - nešpecifický
Slide 35
Sérologická diagnostika
• vhodné je porovnávať vždy párové vzorky sér,
odobraté s odstupom 2 – 3 týždne
• dôkaz sérokonverzie alebo 4-násobný vzostup
protilátok
• KFR je stále zlatý štandard v sérológii
mykoplazmových infekcií
• ELISA IgM sú dobrým ukazovateľom infekcie,
nemusia byť však prítomné pri reinfekciách
• IgA sú dobrým indikátorom čerstvej nákazy
Slide 36
Sérologická diagnostika
• Imunofluorescenčná metóda na dôkaz IgM
- vysoké percento falošne negatívnych
výsledkov (pozit. prediktívna hodnota 50%)
• Western-blot – konfirmačná sérologická
metóda, nie je bežne dostupný v rutinných
laboratóriách
Slide 37
Molekulárno-biologické vyšetrenia
• rýchla detekcia mykoplaziem
• veľmi citlivá, pozitívna aj u pacientov
užívajúcich antibiotiká a sérologicky
negatívnych pacientov
• v porovnaní s klasickou kultiváciou
M. pneumoniae má PCR senzitivitu
asi 78%, špecificitu a pozitívnu prediktívnu
hodnotu 100%
Slide 38
Molekulárno-biologické vyšetrenia
• PCR môže nahradiť pozitívnu kultiváciu
• vzhľadom na nižšiu senzitivitu PCR zo
vzoriek výterov z hrdla by sa mala
kombinovať s KFR
• KFR a kultivácia, resp. PCR umožňuje
spoľahlivú diagnostiku infekcie M.
pneumoniae
Slide 39
Odber, skladovanie a transport
materiálu na laboratórne
vyšetrenie
• materiál na kultivačné vyšetrenie sa odoberá
zásadne v akútnej fáze, do 5 dní od začiatku
ochorenia
• vyšetruje sa hlavne výter z nosohltanu, spútum
a BAL
• malá záchytnosť je z likvoru, pľúcneho tkaniva,
tracheálnych sekrétov, kožných lézií, tracheálneho
aspirátu, pleurálnej a synoviálnej tekutiny
Slide 40
Odber, skladovanie a transport
materiálu na laboratórne
vyšetrenie
• výter sa robí zo zadnej steny nosohltanu
suchým vatovým tampónom (nie
detoxikovaným), ten sa zalomí do
transportného média
• transportné médium a zároveň inokulum pre
kultivačné pôdy je PPLO bujón s
prídavkom želatíny alebo bovinného
albumínu, tháliumacetátu a PNC
Slide 41
Odber, skladovanie a transport
materiálu na laboratórne
vyšetrenie
• spútum – ranné sa odoberá do sterilnej
nádobky
• materiál uchovať až do vyšetrenia v
transportnom médiu v zmrazenom stave
(-20°C a nižšie)
• na sérologické vyšetrenie sa odoberajú
spravidla 2 vzorky krvi (1. v akútnej fáze,
2. o 2-3 týždne), uchovávajú sa pri -20°C
Slide 42
Požiadavky na bezpečnosť
pri práci
• všetky metodiky, materiál a zariadenia
musia zodpovedať úrovni biobezpečnosti 2
(BSL 2)
• nebezpečenstvo laboratórnej nákazy z
vyšetrovaných vzoriek hlavne pri expozícii
slizníc kvapôčkam infekčného aerosólu,
prípadne parenterálna inokulácia alebo
požitie
Slide 43
Požiadavky na bezpečnosť
pri práci
• Likvidácia infekčného materiálu:
- po práci je potrebné nechať usadiť prípadné
aerosóly
- rozliate látky prikryť papierovou vatou a poliať
persterilom 1% (od okrajov k stredu) a nechať
pôsobiť aspoň 30 min.
- infekčný materiál sa likviduje chemickou
dezinfekciou, sterilizáciou parou alebo spálením
Slide 44
Počet pacientov vyšetrených sérologicky na protilátky
proti Mycoplasma pneumoniae a % pozitívnych
za roky 1973 - 2002
Rok
Počet pacientov
% pozitívnych
(resp. vzoriek)
1973
137
1974
81
1975
230
32,5
1976
437
18,9
1977
449
2,9
1978
544
1979
542
1980
319
10,9
1981
507
7,8
1982
524
0,7
1983
525
1984
492
1985
993
20,9
1986
907
27,7
1987
895
11,0
1988
654
6,7
1989
924
13,9
1990
1 096
8,1
1991
1 726
26,0
1992
1 765
7,1
1993
1 254
5,9
1994
1 855
4,3
1995
2 301
15,3
1996
3 205
12,0
1997
2 527
5,4
1998
2 640
3,6
1999
3 054
8,1
2000
2 742
6,5
2001
2 267
28,5
2002
1 325
12,2
Slide 45
P e rc e nto po zitív nyc h na pro tilátk y pro ti M yc o plas m a pne um o niae za
ro k y 1 9 7 3 - 2 0 0 2
35,0
30,0
20,0
15,0
10,0
5,0
Roky
2001
1999
1997
1995
1993
1991
1989
1987
1985
1983
1981
1979
1977
1975
1973
P ercento
25,0
Slide 46
Ďakujem za pozornosť
Mycoplasma pneumoniae
ŠZÚ Banská Bystrica (www.szubb.sk)
NRC pre M. pneumoniae
RNDr. Renáta Kissová
Slide 2
Synonymá a najpoužívanejšie
výrazy
•
•
•
•
•
•
PPLO
pleuropneumonia like organism
mykoplazmová pneumónia
PAP
primárna atypická pneumónia
mykoplasma (mykes-huba, plasmaforma,tvar)
Slide 3
História
• 1898 Nocard a Roux izolovali prvú
mykoplazmu (dnes Mycoplasma mycoides)
• 30-te roky prvé izolácie u človeka,
označované ako PPLO
• 1944 Eaton a spol. izolácia zo spúta
chorých na atypickú pneumóniu, Eatonovo
agens - vírus
Slide 4
História
• 1957 Liu a spol.- metódy sérologického
dôkazu
• 1961 Hayflick izoloval prvýkrát patogéna
na pevnom agare, splnené Kochove
postuláty
• 1963 zaradená medzi baktérie a
pomenovaná Mycoplasma pneumoniae
Slide 5
Fylogenéza
• „degeneratívna evolúcia“ od baktérií s
bunkovou stenou, od grampozitívnych
baktérií druhov Clostridium, Lactobacillus,
Bacillus a Streptococcus
• redukciou genómu a stratou funkcií
potrebných pre syntézu bunkovej steny
Slide 6
Taxonómia
•
•
•
•
•
•
•
Ríša
Oddiel
Trieda
Rad
Čeľaď
Rod
Druh
•
•
•
•
•
•
•
Prokaryotae
Tenericutes
Mollicutes
Mycoplasmatales
Mycoplasmataceae
Mycoplasma
M. pneumoniae
Slide 7
Genóm
• úplná sekvencia genómu
(Himmelreich,1996)
• cirkulárna dvojitá DNA s 816,394 bp
• kódujúce oblasti tvoria 88,7% genómu
• najviac príbuzné k sekvenciám B. subtilis
(vývojová príbuznosť s vetvou
Lactobacillus-Clostridium)
Slide 8
Charakteristika
• pleomorfné mikroorganizmy bez BS
• 100-300 nm - veľkosť poxvírusov
• najmenšie a najjednoduchšie prokaryonty
schopné samostatného rastu a
rozmnožovania (kultivácia na umelých
živných pôdach)
• cytoplazmatická membrána s cholesterolom
(ako u eukaryotických buniek)
Slide 9
Slide 10
Replikačný cyklus
• základný útvarelementárne teliesko
• binárne delenie
• delenie cytoplazmy sa
môže opozďovať za
replikáciou genómumnohojadrové vlákna,
neskôr retiazka
kokovitých útvarov
Slide 11
Epidemiológia
• rozšírené celosvetovo
• vyvolávajú asi 20% pneumónií
( v uzavretých kolektívoch až do 50% )
• častejšie na jeseň a v zime, v miernom
podnebí
• častejšie u malých detí (u starších
reinfekcie)
• u 3-10% infikovaných postihnutie pľúc
Slide 12
Epidemiológia
•
•
•
•
Hostiteľ - len človek, ojedinele primáty
Infekčná dávka - zatiaľ neznáma
Rezervoár - človek
Inkubačná doba - 6-23 dní, zrejme súvisí s
veľkosťou infekčnej dávky
• Infekciozita - osoba je infekčná asi týždeň
po ochorení, najmenej 10 dní
Slide 13
Spôsob prenosu
• kvapôčkovou nákazou
• pomalé šírenie ovplyvňujú 3 faktory:
- nízka infekčnosť pôvodcu
- nízka manifestnosť nákazy
- relatívne dlhá inkubačná doba
• prenos infekcie vyžaduje úzky a dlhodobejší
kontakt, hlavne v komunitách
Slide 14
Virulencia
• spojená s membránovými proteínmi
naviazanými na lipidoch na bunkovom
povrchu
• adhezíny umožňujú mykoplazme
kolonizovať mukózne membrány a povrchy
• sekvencie adhezínov M. pneumoniae nesú
významnú homológiu k štrukturálnym
proteínom cicavcov – poruchy imunity
Slide 15
Virulencia
• tvorba hydrogén peroxidov a
superoxidových radikálov
• kompetícia alebo deplécia živín a
biosyntetických prekurzorov
• prítomnosť púzdru podobnému materiálu
• antigénna variácia
• sekrécia mykoplazmatických enzýmov
• intracelulárna prítomnosť
Slide 16
Imunológia
• dosiaľ nie je úplne objasnená
• tvorba antilipidových protilátok viažúcich
komplement – nezabraňujú možným
reinfekciám, sú len odrazom
predchádzajúcej infekcie
• špecifické IgM protilátky pretrvávajú do
5 mesiacov po infekcii, nemusia sa objaviť
pri reinfekcii
Slide 17
Imunológia
• uplatňuje sa tiež imunita sprostredkovaná
bunkami
• rezistencia k infekcii je výsledkom
komplexného pôsobenia rady imunitných
pochodov
• pri prvom kontakte s infekciou dochádza k
senzibilizácii organizmu, pri ďalšom
kontakte plne rozvinuté ochorenie
Slide 18
Patogenéza
• doposiaľ nie je úplne preskúmaná
• patogenetický účinok je vyvolaný dvoma
mechanizmami:
- účinok toxických substancií
produkovaných mikroorganizmom
- účasť hostiteľskej imunitnej odpovede
Slide 19
Klinické príznaky
• Pľúcne manifestácie
- typický je ľahký, spontánne sa hojaci
respiračný infekt
- pozvoľný začiatok, teplota, únava, kašeľ,
bolesti hlavy a svalov
- faryngitída, tracheobronchitída, bronchitída
- zriedka konjunktivitída, otitída, sínusitída,
syndróm dychovej tiesne
Slide 20
Klinické príznaky
- počet leukocytov normálny, niekedy
eozinofília, vysoká sedimentácia
- slabé auskultačné nálezy
- u 3-10% osôb rozvoj pneumónie
- zväčša mierny priebeh, atypická pneumónia
- bežné sú subklinické infekcie
- u osôb s imunodeficitom je veľké riziko
pľúcnych komplikácií
Slide 21
Klinické príznaky
• Mimopľúcne
maniestácie
- veľmi pestré, môžu
postihnúť každý orgán
- objavujú sa 1-23 dní
po začiatku
respiračných potiaží,
- aj bez respiračného
ochorenia
Slide 22
Klinické príznaky
• Neurologické komplikácie
(meningoencefalitída, aseptická
meningitída, vzostupná paralýza, GBS, atď)
- u niektorých pacientov trvalé postihnutie v
podobe chabých obŕn, para- a hemiplégie,
afázie
- izolácia M. pneumoniae z likvoru sa
podarila len v ojedinelých prípadoch
Slide 23
Klinické príznaky
• Hematologické komplikácie
- U 33-76% sa objavia chladové aglutiníny,
následkom čoho vzniká hemolytická anémia
s pozitívnym Coombsovým testom,
2-3 týždne od začiatku ochorenia
- Raynaudova choroba, útlm kostnej drene,
hemoglobinúria, trombocytopénia,
diseminovaná intravaskulárna koagulácia
Slide 24
Klinické príznaky
• Dermatologické komplikácie
- zmeny na koži a slizniciach obvykle
2 týždne od začiatku ARO
- exantém – klinicky nezávažné
- erythema multiforme major,
- Stevens-Johnsonov syndróm
Slide 25
Klinické príznaky
•
•
-
Kardiologické komplikácie
postihnutie myokardu u 4,5% infikovaných
perikarditída, myokarditída, kompletný blok
Gastrointestinálne a renálne komplikácie
nešpecifické (strata chuti do jedla, zvracanie,
hnačka)
• Rôzne
- bolesti svalov a kĺbov
Slide 26
Citlivosť na antibiotiká
•
•
-
Lieky voľby:
Tetracyklíny ( doxycyklín )
Makrolidy ( erytromycín, azitromycín )
Citlivé aj na:
Aminoglykozidy ( gentamycín )
Linkozamíny ( klindamycín )
Fluorochinolóny ( trovafloxacín )
Slide 27
Citlivosť na antibiotiká
Terapia by mala trvať 10-14 dní
• Rezistencia na antibiotiká:
- prirodzene rezistentná na penicilíny a
cefalosporíny
- rezistencia na rifampicín a trimethoprim
- ojedinele na tetracyklín (gén tetM)
• Vakcinácia: doposiaľ sa nepodarilo
pripraviť účinnú vakcínu
Slide 28
Laboratórna diagnostika
• Kultivácia
• Mikroskopické
vyšetrenia
• Sérologické vyšetrenia
• Molekulárnobiologické vyšetrenia
Slide 29
Kultivácia M. pneumoniae
• veľmi náročná a zdĺhavá
• na pevných, tekutých a difázických pôdach
• PPLO agar a bujón (konské sérum,
kvasnicový extrakt, D-glukóza,
pH indikátor a antibiotiká)
• pri 36-37°C a atmosfére 5%CO2 a 95%N2
alebo za aeróbnych podmienok
Slide 30
Kultivácia M. pneumoniae
• trvá 7-14 dní (so subkultiváciou niekoľko
týždňov)
• kolónie na agare sú typické, vzhľadu
„volského oka“, okrúhle, čiastočne vrastené
do agaru, s priemerom 10-100 μm
• odčítava sa mikroskopicky pri zväčšení 30100 x
• vykonávajú sa najmenej 3 slepé pasáže
Slide 31
Kultivácia M. pneumoniae
• farbenie kolónií
Dienesovým farbením
• odlíšenie
pseudokolónií
(kryštály kalciových
a magnéziových solí)
zahriatím na 60°C
30min
Slide 32
Kultivácia M. pneumoniae
• Diferenciácia mykoplaziem:
- na základe rozdielnej metabolickej aktivity
(ureaplazmy metabolizujú ureu,
M. fermentans metabolizuje glukózu a arginín,
M. hominis arginín, M. genitalium
a M. pneumoniae skvasujú glukózu)
- rastovo inhibičný test – jednotlivé druhy
mykoplaziem sa dokazujú za pomoci
hyperimúnnych sér
Slide 33
Schéma vyšetrenia materiálu na
prítomnosť mykoplaziem
Biologický materiál
PPLO bujón
PPLO agar
PPLO bujón
PPLO agar
PPLO agar
pozitívny
PPLO bujón
Negatívny - ex
Negatívny - ex
pozitívny
pozitívny
Negatívny - ex
PPLO agar
identifikácia
PPLO bujón
PPLO agar
identifikácia
Slide 34
Sérologická diagnostika
• Dôkaz protilátok proti celobunkovým alebo
izolovaným mykoplazmovým antigénom:
- KFR
- ELISA
- imunofluorescenčný test
- Western-blot
• Chladový aglutinačný test - nešpecifický
Slide 35
Sérologická diagnostika
• vhodné je porovnávať vždy párové vzorky sér,
odobraté s odstupom 2 – 3 týždne
• dôkaz sérokonverzie alebo 4-násobný vzostup
protilátok
• KFR je stále zlatý štandard v sérológii
mykoplazmových infekcií
• ELISA IgM sú dobrým ukazovateľom infekcie,
nemusia byť však prítomné pri reinfekciách
• IgA sú dobrým indikátorom čerstvej nákazy
Slide 36
Sérologická diagnostika
• Imunofluorescenčná metóda na dôkaz IgM
- vysoké percento falošne negatívnych
výsledkov (pozit. prediktívna hodnota 50%)
• Western-blot – konfirmačná sérologická
metóda, nie je bežne dostupný v rutinných
laboratóriách
Slide 37
Molekulárno-biologické vyšetrenia
• rýchla detekcia mykoplaziem
• veľmi citlivá, pozitívna aj u pacientov
užívajúcich antibiotiká a sérologicky
negatívnych pacientov
• v porovnaní s klasickou kultiváciou
M. pneumoniae má PCR senzitivitu
asi 78%, špecificitu a pozitívnu prediktívnu
hodnotu 100%
Slide 38
Molekulárno-biologické vyšetrenia
• PCR môže nahradiť pozitívnu kultiváciu
• vzhľadom na nižšiu senzitivitu PCR zo
vzoriek výterov z hrdla by sa mala
kombinovať s KFR
• KFR a kultivácia, resp. PCR umožňuje
spoľahlivú diagnostiku infekcie M.
pneumoniae
Slide 39
Odber, skladovanie a transport
materiálu na laboratórne
vyšetrenie
• materiál na kultivačné vyšetrenie sa odoberá
zásadne v akútnej fáze, do 5 dní od začiatku
ochorenia
• vyšetruje sa hlavne výter z nosohltanu, spútum
a BAL
• malá záchytnosť je z likvoru, pľúcneho tkaniva,
tracheálnych sekrétov, kožných lézií, tracheálneho
aspirátu, pleurálnej a synoviálnej tekutiny
Slide 40
Odber, skladovanie a transport
materiálu na laboratórne
vyšetrenie
• výter sa robí zo zadnej steny nosohltanu
suchým vatovým tampónom (nie
detoxikovaným), ten sa zalomí do
transportného média
• transportné médium a zároveň inokulum pre
kultivačné pôdy je PPLO bujón s
prídavkom želatíny alebo bovinného
albumínu, tháliumacetátu a PNC
Slide 41
Odber, skladovanie a transport
materiálu na laboratórne
vyšetrenie
• spútum – ranné sa odoberá do sterilnej
nádobky
• materiál uchovať až do vyšetrenia v
transportnom médiu v zmrazenom stave
(-20°C a nižšie)
• na sérologické vyšetrenie sa odoberajú
spravidla 2 vzorky krvi (1. v akútnej fáze,
2. o 2-3 týždne), uchovávajú sa pri -20°C
Slide 42
Požiadavky na bezpečnosť
pri práci
• všetky metodiky, materiál a zariadenia
musia zodpovedať úrovni biobezpečnosti 2
(BSL 2)
• nebezpečenstvo laboratórnej nákazy z
vyšetrovaných vzoriek hlavne pri expozícii
slizníc kvapôčkam infekčného aerosólu,
prípadne parenterálna inokulácia alebo
požitie
Slide 43
Požiadavky na bezpečnosť
pri práci
• Likvidácia infekčného materiálu:
- po práci je potrebné nechať usadiť prípadné
aerosóly
- rozliate látky prikryť papierovou vatou a poliať
persterilom 1% (od okrajov k stredu) a nechať
pôsobiť aspoň 30 min.
- infekčný materiál sa likviduje chemickou
dezinfekciou, sterilizáciou parou alebo spálením
Slide 44
Počet pacientov vyšetrených sérologicky na protilátky
proti Mycoplasma pneumoniae a % pozitívnych
za roky 1973 - 2002
Rok
Počet pacientov
% pozitívnych
(resp. vzoriek)
1973
137
1974
81
1975
230
32,5
1976
437
18,9
1977
449
2,9
1978
544
1979
542
1980
319
10,9
1981
507
7,8
1982
524
0,7
1983
525
1984
492
1985
993
20,9
1986
907
27,7
1987
895
11,0
1988
654
6,7
1989
924
13,9
1990
1 096
8,1
1991
1 726
26,0
1992
1 765
7,1
1993
1 254
5,9
1994
1 855
4,3
1995
2 301
15,3
1996
3 205
12,0
1997
2 527
5,4
1998
2 640
3,6
1999
3 054
8,1
2000
2 742
6,5
2001
2 267
28,5
2002
1 325
12,2
Slide 45
P e rc e nto po zitív nyc h na pro tilátk y pro ti M yc o plas m a pne um o niae za
ro k y 1 9 7 3 - 2 0 0 2
35,0
30,0
20,0
15,0
10,0
5,0
Roky
2001
1999
1997
1995
1993
1991
1989
1987
1985
1983
1981
1979
1977
1975
1973
P ercento
25,0
Slide 46
Ďakujem za pozornosť