Transcript Genų inžinerija

4.3. Miško medžių genetinės
inžinerijos pasiekimai.
Pagrindinės kryptys:
• Lignino modifikacija.
•Atsparumas virusams, vabzdžiams ir ligoms.
•Atsparumas herbicidams.
•Žydėjimo ir lytinės brandos modifikacija.
•Atsparumas abiotiniam stresui (adaptacija)
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Dalis medžiagos paruošta pagal
A.Sliesaravičiaus ir V. Stanio leidinį (2005)
Vis dažniau įvairiuose informacijos šaltiniuose sutinkami terminai:
“ šiuolaikinė biotechnologija”
“genų inžinerija”
“genetiškai modifikuoti organizmai”
Visa tai nusako viena – naujausius pasiekimus genetikoje (genetikos
srityje). Ir šie pasiekimai suteikia galimybes aktyviai dalyvauti
paveldimumo proceso pažinime, įsikišti į patį procesą, keisti jį norima
kryptimi ir sukurti naujas augalų rūšis, turinčias naujų pageidaujamų
savybių, kurių neįmanoma išgauti tradicinės selekcijos būdu.
Maistas yra nuolatinis eksperimentas ir augalų bei gyvūnų selekcija yra
vykdoma daug šimtmečių
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Tradicinės selekcijos efektyvumas didele dalimi priklauso nuo vidurūšinio
kintamumo, tačiau yra rūšių (pvz, Pinus resinosa), natūraliai turinčių žemą
kintamumo lygį. Dauguma kultūrinių augalų iš viso neturi kai kurių vertingų
genų (pvz. genai atsparumui ligoms ir kenkėjams), o tai taip pat riboja
selekcijos efektyvumą.
Genetinės inžinerijos uždavinys selekcijoje – padidinti kintamumą.Tam į
augalus recipientus įkeliami genai iš kitų organizmų arba dirbtinai susintetinti,
pakeisti genai. Poligenų nulemtus požymius yra sunkiau valdyti genų
inžinerijos metodais. Pagrindinis augalų transformacijos pranašumas, palyginti
su kitais selekcijos metodais yra tai, kad galima įkelti atskirą geną be kitos
genomo dalies.
Augalai, sukurti genų inžinerijos metodais, kurie leidžia izoliuoti geną iš bet
kurio gyvo organizmo ir įkelti bei integruoti jį į tiriamo augalo genomą,
vadinami transgeniniais augalais.
Augalai, gauti somatinės hibridizacijos metodais vadinami transgenominias
augalais.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Genų inžinerija – rekombinantinių DNR molekulių technologijos – yra pats
efektyviausias būdas fundamentinėms genų ir biologijos problemoms spręsti, taikant
molekulinės biologijos metodus. Ji leidžia:
-
izoliuoti genus iš donoro genomo, kurti genetines bibliotekas;
-
klonuoti genus, pažinti jų struktūrą ir funkcijas;
įkelti geną į recipiento organizmą taip, kad jis aktyviai veiktų ir būtų
perduodamas kitoms kartoms.
Genų inžinerija gali būti naudojama pažinimo ir praktiniais tikslais. Pažinimo tikslus
realizuojame manipuliuodami su genetine medžiaga ir stebėdami šių manipuliacijų
įtaką genų pasireiškimui. Praktiniai tikslai pasiekiami, kai sukaupta informacija leidžia
suteikti organizmams norimus požymius.
Prielaidos atsirasti genų inžinerijai susidarė nustačius DNR genetinį vaidmenį ir DNR
molekulės struktūrą (Awery et al., 1944, Watson, Crick, 1953). Vėliau (1961-1966)
buvo iššifruotas genetinis kodas, nustatyta prokariotų genų veiklą reguliuojančių
elementų sudėtis. XX a. septintojo dešimtmečio pradžioje biochemikai atrado
restrikcijos-modifikacijos reiškinį, enzimologai genų inžinerijai pateikė platų
instrumentų-fermentų rinkinį įvairioms manipuliacijoms su DNR, mikroorganizmų
genetikai nurodė metodus, kaip sukonstruotas in vitro DNR molekules įkelti į
recipiento ląsteles. 1972 m. P.Berg laboratorijoje gauta pirmoji rekombinantinė DNR
sujungiant DNR fragmentus. Ši data laikoma genetinės inžinerijos gimimo data.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Skiriama genų ir genominė inžinerija:
•Genų inžinerija sprendžia fundamentinius ir praktinius vieno arba kelių
svetimų genų įvedimo, naujų genų reguliavimo ryšių sukūrimo, molekulinės
genomo struktūros, genų veiklos reguliavimo, jų reiškimosi problemas ir kt.
Šiuo atveju recipiento rūšinė priklausomybė nesikeičia, tik pasireiškia
nebūdingi požymiai.
•Genomo inžinerijos atveju daug smarkiau kišamasi į genomą, kas gali
sukelti naujų rūšių atsiradimą.
Genetiškai modifikuotas organizmas (GMO) – organizmas, išskyrus žmogų,
kurio genetinė medžiaga yra taip pakeista ir įgijusi tokių savybių, kurių
negalėtų atsirasti organizmui dauginantis natūraliu būdu.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Genų inžinerija
Turinys
Etapai
Priemonės
Oragnizmų su naujais, In vivo: genų išskyriVirusai, plazmidės,
nebūdingais rūšiai
mas, jų perkėlimas į
transpozonai
požymiais
naują genetinę aplinką
konstravimas
In vitro: genų sintezė
arba išskyrimas, jų
modifikavimas,
įjungimas į vektorius,
įkėlimas į ląstelę,
klonavimas
Restrikcijos-endonukleazės, DNRligazės, atvirkštinė
transkriptazė ir kitos
polimerazės, vektoriai
ir kt.
Genų perkėlimo
metodai
Transdukcija,
konjugacija, transpozicija, protoplastų
suliejimas
Transformacija,
mikroinjekcija,
elektroporacija ir kt.
Genomo inžinerija
Turinys
Naujų rūšių individų
kūrimas
V.Baliuckas
Objektas
Konstravimo metodai
Virusai
Rekombinacija in vivo ir in vitro
Prokariotų ląstelės
Tarprūšinė konjugacija ir protoplastų suliejimas
Eukariotų ląstelės
Protoplastų suliejimas, izoliuotų branduolių,
chromosomų įkėlimas, chromosomų
mikroinjekcija į branduolius, izoliuotų
mitochondrijų ir chloroplastų perkėlimas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Genų šaltiniai
Genai
Augalų virusai
Produktas
Rezultatas
Antiprasminė RNR,
inhibitoriai, imuniškumo
genai, diagnozavimo
priemonės
Diagnostikai, bevirusinė
sodinamoji medžiaga,
atsparumas virusams
Entomopatogenai,
toksinai
Biologiniai pesticidai
Vabzdžiams kenksmingi organizmai
Δ-toksinas
Fotosintezuojantys
prokariotai
Genas
Rubisco
Agrobacterium
tumefaciens
antagonistai
pSA tipo
plazmidė
Fitohormonų sintezės
slopinimas
Išaugų susidarymo
slopinimas
Herbicidams atsparūs
mikroorganizmai
Atsparumo
herbicidams
Herbicidų skaldymas
Kultūrinių augalų
atsparumas
Herbicidams atsparūs
augalai
Atsparumo
herbicidams
Nepatekimas į ląstelę
Kultūrinių augalų
atsparumas
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Fotosintezės efektyvumo
padidinimas
Genų šaltiniai
Genai
Produktas
Rezultatas
Gyvūnai
Interferonas
Egzogeninis ir
endogeninis interferonas
Augalų imunitetas
Gyvūnai
Antiprasminis
prieš RNR
virusus
Antiprasminė RNR
Imunitetas virusams
Augalai
Atsarginiai
baltymai
Atsarginiai baltymai su
pakeista amino rūgščių
sudėtimi
Padidinta maistinė ir
pašarinė vertė, sintetina
kitos rūšys
Augalai
Gumbelių
susidarymą
koduojantys
genai
Produktai, stimuliuojantys
gumbelių susidarymą
Pakeista azoto įsavinimo
sistema
Augalai
Rubisco
Augalai su susilpnintu
fotokvėpavimu
Fotosintezės efektyvumo
padidinimas
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Produktyvumo padidinimas
Šis požymis yra kiekybinis. Jį lemia daugelio genų adityvinė veikla. Todėl pasirinkta
strategija modifikuoti reguliuojančius genus, įkeliant hemoglobino genus iš
gramneigiamos Vitreoscilla bakterijos. Tai padeda geriau aprūpinti augalo fiziologinius
procesus deguonimi.
Atsparumas herbicidams
Augalų tolerancija herbicidams buvo pirmoji transgeninė savybė, kuri buvo
komercializuota. Ši savybė labai plačiai naudojama agrokultūroje. Tolerancijos
herbicidams genai įkeliami į įvairiausius augalus. Tai labai palengvina pasėlių
priežiūrą. Klonuoti ir įkelti į aukštesniuosius augalus atsparumo glifosatui (Roundap),
fosfinotricinui (BASTA), dalaponui genai, naudojama genetinė transformacija
gliufosinatui, triazinui.
V.Baliuckas
ROUNDUP’ui atsparios GM sojos
pupelės
(dešinėje)
Genetikos ir
selekcijos skyrius
Herbicidams atsparios GM pušys
(kairėje)
Atsparumas virusams
Virusinių ligų pažeisti augalai yra lengviau infekuojami kitų patogenų, patys
kaupia virusus ir yra užkrato šaltinis. Virusinę infekciją galima slopinti įkeliant į
augalo genomą genus, koduojančius specifinius antikūnius ir atpažįstančius
virusinius baltymus. Infekcijos atveju tarp susintetintos RNR ir virusinės RNR
susidaro dupleksai. Šie suardomi specialia RNA-ze ir liga sustabdoma.
Atsparumas grybinėms ligoms
Augalai pasižymi daugiakomponente atsako į grybinę infekciją sistema, kuri
tinkamu laiku ir tinkamoje vietoje bei pakankamu intensyvumu aktyvinta gali
apsaugoti nuo grybų patekimo. Įkėlus aktyvų chitinazės geną, dažnai
sustiprėja augalų atsparumas grybinėms ligoms.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Atsparumas vabzdžiams
Pagrindinai baltymai, lemiantys atsparumą kenkėjams, yra proteazių inhibitoriai, ir
Bacillus thuringiensis endotoksinai, taip pat α-amilazių inhibitoriai, lektinai ir
neuropeptidai.
Iš Bacillus thuringiensis išskirtas genas, koduojantis toksišką vabzdžiams ir nepavojingą žinduoliams baltymą. Šis baltymas sukelia vabzdžių skrandžio ir žarnyno epitelio
irimą ir labai selektyviai veikia įvairias vabzdžių rūšis. Proteazių inhibitoriai yra baltymai
arba polipeptidai, kurie prisijungia prie proteolitinių fermentų aktyviųjų centrų ir slopina
jų katalitinį aktyvumą (slopinamas vabzdžio lervos augimas ir jų daugiau žūva).
Šiuo metu tiriamos atsparios vabzdžiams bulvių, obelų, graikinio riešutmedžio formos
(A.Sliesaravičius, V.Stanys, 2005).
V.Baliuckas
GM kenkėjams toksiški
kukurūzai (dešinėje)
Genetikos ir selekcijos skyrius
GM ekspresuoto pesticidiškumo
tuopų lapai (kairėje)
Atsparumas abiotiniams veiksniams
Abiotiniai veiksniai (sausra, šaltis, mineraliniai toksinai) lemia augalo produktyvumą
ir jo raidą. Įkėlus genus, koduojančius fermentą superdismutazę, augalai su
didesniu šio fermento kiekiu buvo labiau atsparūs herbicidams, ozonui ir sausrai.
Didinant atsparumą šalčiui keičiamas santykis tarp sočiųjų ir nesočiųjų riebiųjų
rūgščių, didinamas ląstelės osmosinis slėgis.
Siekiant padidinti atsparumą sunkiesiems metalams, į augalus perkeliamas genas
iš gyvūnų, koduojantis baltymo metalotioneino sintezę. Šis baltymas sujungia
sunkiuosius metalus.
Vyriško sterilumo indukavimas
Kuriant heterozinius hibridus, labai svarbu kontroliuoti augalų sterilumą. Klonuotas
”genas-žudikas” (barnasė) pasireiškia tik žiedadulkių formavimosi metu, todėl
žiedadulkės nesivysto. Norint atkurti augalų fertilumą, buvo klonuotas genas
(bastar), kurio produktai sujungia ”geno-žudiko” produktus. Tokiu būdu buvo
sukurta vyriško sterilumo linijų gavimo ir jų fertilumo atkūrimo bet kuriai augalų
rūšiai sistema.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Genetinės modifikacijos taikymo žemės ūkyje proceso sudėtinės dalys ir
laiko trukmė
Geno
identifikacija
24-48 mėn.
Duomenų
tikrinimas
12-24 mėn.
Technologijos
išvystymas
Technologinis
suderinimas
12-24 mėn.
12-24 mėn.
Galutinis
pateikimas
12-36 mėn.
Laiko intervalas nuo pradžios iki galutinio rezultato apima 6-13 metų,
o miško medžiams tai užtruktų žymiai ilgiau
Ateities perspektyvos 2005-2015
Atsparumas herbicidams, kenkėjams ir patogenams
 Atsparumas sausrai, padidintam druskingumui, sunkiųjų metalų
taršai, temperatūrų ekstremumams
 Pagerinimas kultivuojamų žemės ūkio kultūrų maistinės vertės
ir laikymo trukmės
 Pagerinimas kultivuojamų kultūrų aromatinių savybių
 Alergenų pašalinimas
 Farmaceutinių medicinai naudojamų augalų savybių didinimas
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Vasil I.K. 2003
GMO nauda
1. Ekonominė
2. Socialinė ir ekologinė.Mažėjant pesticidais apdirbamų ir intensyvai ariamų laukų
plotams mažiau nadojama žemės ūkio technika, o tuo pačiu mažėja išlaidos
degalams ir anglies dvideginio išmetimas į atmosferą. Mažiau teršiams herbicidais
gruntas ir vanduo. Nenaudojant laukuose insekticidų padidėja naudingų vabzdžių.
2/3 maisto produktų JAV supermarketuose turi sudėtyje
genetiškai modifikuotų augalų
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Medžiai taip pat sulaukia vis
didėjančio dėmesio genetinės
inžinerijos srityje!
Tuopos ir drebulės - Populus
Mediena (pjautiniams gaminiams,
popieriui)
Panaudojama kaip modelinė rūšis kitų
rūšių tyrimuose
Oregono valstija – 7 metų amžiaus tuopų
plantacija
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Miško medžių rūšių
transgeninė domestikacija
EST ar genomo sekos
Mikrogardelių ekspresijos studijos
Kandidatinių genų identifikavimas
• Modifikuojama mediena – popieriaus masei,
pjautiniams sortimentams, energijai
• Modifikuojama lajos struktūra
• Žydėjimo kontroliavimas
-sterilumas: padidintas produktyvumas, genų
pasiskleidimo išvengimas, alerginių medžiagų
sumažinimas (žiedadulkės ar vaisiai)
-indukcija: trumpesnis selekcijos ciklas, naujos
selekcijos galimybės
• Atnaujinimas – kloninis dauginimas
Funkcinė analizė panaudojant
transgeninius medžius (galimai)
Fenotipinė analizė panaudojant
lauko ar šiltnamio bandymus
Genetinio atsako tikslinimas
Selekcionuoti varietetai, selekcija
genų pagrindu (GAS)
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
• Kenkėjų kontroliavimas – atsparumas
vabzdžiams, ligoms ir herbicidams
• Kiti požymiai – vaistinių savybių pagerinimas
Genetiškai modifikuotų augalų keliami pavojai ir jų vertinimas
Genetiškai modifikuoti organizmai:
- patys gali neturėti tiesioginės neigiamos įtakos žmonių sveikatai, bet jų
metabolizmo produktų poveikis gali būti toksiškas arba alerginis ir pasireikšti daug
vėliau po kontakto su tokiais organizmais;
- gali būti patogeniški žmonėms, kurie turi imunitetą natūraliai egzistuojantiems
organizmams;
- gali būti potencialus nepageidaujamų genų kombinacijų perdavimo kitoms
organizmų rūšims horizontalaus genų dreifo metu šaltinis;
- gali pasireikšti netikėtų požymių genetiškai modifikuotuose augaluose,
neprognozuojamai pakisti augalų populiacijos dėl konkurencinio pranašumo,
palyginti su nepakeistais augalais.Tai iš esmės gali pakeisti evoliucijos kryptį ir
sukelti nevienodas pasekmes teik gyvūnams, augalams, tiek ir žmonėms.
Genų inžinerija palyginti nauja biotechnologijos sritis ir iki šiol pasaulyje ji
vertinama nevienareikšmiškai. Didžiausias pavojus iškyla kai genetiškai
modifikuoti augalai ar gyvūnai išleidžiami į aplinką, kur jie turi galimybę kryžmintis
su laukiniais augalais ar gyvūnais. Taip gali būti sunaikintas natūralus
genofondas, pažeistas ekosistemų stabilumas.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Efektyvumas, tikslumas ir atsakomybė
• Tyrimai yra brangūs, ypač genomikoje
– tikslas yra kokybiškos žinios ir socialinė nauda
• Genetinės transformacijos svarba yra lemianti
• Dauguma svarbių miško biologijai požymių yra nepakankamai išreikšti juvenaliniame
amžiuje ar užauginti laboratorijoje
– lauko bandymai yra labai reikalingi ir lemiami
• Sterilūs (lytiškai) ar nebrandūs medžiai turėtų būti naudojami tyrimuose
• Transgeninės genų modifikacijos pasižymi tuo, kad yra paveldimos ir laikui bėgant
domestikuojasi: stabilizuojanti selekcija
– modifikuojami požymiai pasižymi didele variacija ir yra paveldimi
– reti transgeniniai mutantai lauko bandymuose yra “paskandinami” foninių žiedadulkių
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Lignino genetinė modifikacija
Lignino sandara
Medienos ląstelės pagrinde sudarytos iš celiuliozės,
hemiceliuliozės ir lignino, kuris supaprastintai vadinamas
ląstelių klijais.
Kaip ir celiuliozė, ligninas sudarytas iš C, H ir O2, tačiau jie
išdėstę skirtingai, suformuodami skirtingas molekules,
klasifikuojamas kaip fenolių polimerai, sudaryti iš fenopropano monomerų.
Ligninas pagrinde randasi tarpląstelinėje terpėje ir suklijuoja
ląsteles vieną prie kitos. Apytikriai liginas sudaro 1/3 sausos
medienos masės ir yra svarbus komponentas celiuliozės
gamyboje. Ligino ypač daug kompresinėje medienoje (stiebo
sulinkimo pusėje).
Pušies
kompresinė
mediena
(žym.
rodyklėmis)
Pušies medienos ląstelės
(tracheidės) (5 mm ilgio plonos
ląstelės)
Ksilemos medienos ląstelės
(tracheidės) struktūra. W- tuščias
vidus (lumen). ML- tarpląstelinė
terpė pripildyta lignino. Ląstelės
sienelė: P- pirminė, S1, S2, S3-3
antrinių sienelių sluoksniai.
Brūkšneliai ant sienelių parodo
mikrofibriles.
D. Danusevičius
Pagrindinės liginio funkcijos ir ekonominis
panaudojimas
Biologinės funkcijos
Liginas užpildo tarpląstelinę terpę taip suklijuodamas ląsteles ir
priduodamas medienai tvirtumą.
Ruošiantis žiemai, medelių ūgliai lignifikuojasi- virsta iš žalių
sultingų į sumedėjusius rudus- tarpląstelinėje terpėje sparčiai
sintetinamas ligninas virsta į želė formos masę ir apsaugo
medienos ląsteles nuo šalčio).
Ligninas padeda formuoti vandens indus, ligniną sunku suskaldyti
todėl jis yra efektyvus fizinis barjeras ento ir fito kenkėjams
Picea abies sėjinukų stiebelių
lignifikacja A- lignifikuota, B
(užsikrėtus grybine liga padidėja lignino sintezė).
nelignifikuota dlays.
Ekonominis panaudojimas:
Daugiau lignino: tvirtesnė mediena, didesnė energetinė vertė
(ligninas išskiria daugiau energijos nei celiuliozė),
Mažiau lignino: popieriaus gamyboje, kur celiuliozė atskiriama nuo
lignino, kas yra ekonomiškai ir ekologiškai brangus procesas.
Todėl mažesnis ligino kiekis pageidaujamas požymis popieriaus
masės gamyboje, kai reikia atskirti ligniną nuo celiuliozės.
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai
Lignino kiekio sumažinimas naudojant Antisens
geno įterpimą
Sens ir antisens DNR
paaškinimas
Sens
grandinė
koduojanti
geną
Dabartiniu metu yra nustatyta dauguma
su liginio sinteze susijusių enzimų ir jos
koduojančių genų. Dešinėje parodytas
lignino polimerizacijos iš monolignolių
schema, kur dalyvauja du enzimai
Oksidazė ir peroksidazė.
2
Lignino genas
Jai atvirkščia
DNR seka
vad.
antisens
Pinus
medienos
ląstelės
3
DNR
DNR
RNR
Lignino geno
iRNR
DNR
DNR
Naujo geno
iRNR
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai
Naujas genas
RNR
RNR
Galima dirbtinai įterpti naują geną, produkuojantį iRNR, kuri
yra komplimentari (tinkanti jungčiai) su liginio geno iRNR.
Tokiu būdu bus sumažintas lignino kiekis medienoje.
1
DNR
Dviejų
grandinių
iRNR
DNR
Tyrimų pavyzdys: lignino modifikacija Populus
Identifikuotas vienas iš lignino sintezėje
dalyvaujančių genų 4CL ir sumažinta jo
ekspresija, naudojant antisens metodą.
Pakeitus lignino sudedamų dalių syringilio ir
guaiacylio santykį, galima lengviau atskirti
ligniną nuo celiuliozės (Pinus radiata Jounin ir
Goujon 2004).
Identifikuotas vienas iš syringilio sintezėje
dalyvaujančių genų- CAld5H (reguliuojančio
syringilio sintezės intensyvumą) ir modifikavo
CAld5H ir 4CL genų ekspresiją drebulėje.
Rezultate GMM turėjo 52 proc. mažiau lignino,
taip pat GMM buvo pagreitinta ksilemos ląstelių
branda (Populus Chiang ir kt. (2003).
Ref.: "Combinatorial modification of multiple lignin traits in trees
through multigene cotransformation" by Laigeng Li, Yihua Zhou, Xiaofei
Cheng, Jiayan Sun, Jane M. Marita, John Ralph, and Vincent L. Chiang. PNAS
NEWS http://www.pnas.org/misc/archive033103.shtml
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai
Transgeninės drebulės su padidinta
CAld5H geno ekspresija ląstelės
parodė didesnį jų senelių storėjimo
greitį (matoma reporterinio geno
ekspresija).
Atsparumas oksidaciniam stresui
Tokie aplinkos stresai kaip ozonas, intensyvi šviesa, karšis ir
sausra gali sukelti oksidacinį stresą augalo ląstelėse.
Oksidacinis stresas (OS) apibrėžiamas kaip žalingų laisvųjų
radikalų molekulių kaupimasis augalo ląstelėse. Laisvieji radikalai
tai atomai ar jų grupės turintys neporinį elektronų skaičių (laisvą
elektroną) ir todėl yra labai reaktyvūs, gali pažeisti ląstelių
sienelės, baltymų ir DNR molekules. Molekuliniame lygmenyje OS
sukeliamas kai laisvieji radikalai prisijungia iš kitos molekulės
deguonies atomo vieną elektroną. Šioje formoje deguonis sudaro
ypač reaktyvius hidrokslio radikalus.
Enzimas superoksidismutazė (SOD) skaldo laisvuosius radikalus ir
taip juos neutralizuoja. Genetinė modifikacija, šiuo atveju, galima
įterpti modifikuotą SOD geną su dažniau transkribuojamu
promotoriumi ar įterpiant daugiau SOD geno kopijų.
Bandymai parodė, kad tabako augalai su padidinta SOD geno
ekspresija buvo labiau atsparūs ozono poveikiui, o GM medvinės ,
alfaalfa ir kukurūzų augalai buvo atsparesni aplinkos stresams
(Breusegem ir Inze 2004).
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai
Atsparumas oksidaciniam stresui
Su sumedėjusiais augalais tyrimai atliekami Suomijos
biotechnologijos institute, kur Betula pendula medeliai
paveikiami kritinėmis ozono dozėmis, kas sukelia laisvų radikalų
formavimąsi ląstelių sienelėse bei kartu aktyvuoja už šių radikalų
neutralizaciją atsakingus genus.
Iš kontrolinių ir paveiktų medelių tų pačių audinių identifikuojami
tie genai, kurie buvo išreikšti stresą patyrusiuose augaluose bet
nebuvo išreikšti kontroliniuos augaluose (2 to pačio genotipo
kopijos gali būti naudojamos kaip kontrolė ir kaip testuojamas
augalas, taip eliminuojant skirtingų genotipų efektą)
Šie kandidatiniai genai toliau tiriami: sekvenuojami, skaidomi į
funkcines dalis, lyginami su genais duomenų bazėse bei
naudojami GM išbandymuose. Indukuojamos dirbtinės mutacijos
ir stebima kuris iš kandidatinių genų turi stipresnę įtaką požymio
išraiškai.
Kadangi O3 poveikis aktyvuota etileno sintezės genų veiklą,
bandoma etileno kaip signalinės molekulės apie stresą
perdavėjo vaidmuo atsakant į laisvų radikalų atsiradimą ir
atitinkamų gynybinių genų aktyvaciją (Arabidobsis).
Pagrinde tyrimai su tabaku ir arabidobsis (Breusegem ir Inze
2004).
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai
Laisvų radikalų formavimasis betula
pendula ląstelių sienelėse paveikus
ozonu.
Išreikštų genų
identifikacijos
modelis
DNR
RNR
Atsparumas virusams
Po bakterijų ir grybinių ligų virusai yra trečia pavojingiausia
augalams patogenų (mikroorganizmų sukeliančių
pakenkimus) kategorija. Virusai įsiterpia į apkrėstos
ląstelės DNR ir dideliais kiekiais gamina savo
apvalkinio baltymo ir DNR ar RNR kopijas ir taip
sutrikdo normalų ląstelės funkcionavimą ar indikuoja
užprogramuotą ląstelių žuvimą, kad išvengti kaimynių
audinių infekcijos.
Genetinė modifikacija gali padėti (Jeske 2004):
Virusinio pobūdžio lapų pakenkimai
(a) Kosupresija, kai identifikuojamas viruso baltyminio apvalkalo sintezės genas ir
jis įterpiamas į augalo DNR, virusinės infekcijos atveju, augalo imuninė sistema
greičiau sureaguoja į padidintą šio geno išraišką ir blokuoja tiek virusinio tiek
modifikuoto geno transkripciją (paprastai metilinant geno promotorių).
(b) Antisens metodai, kai įterpiami virusinių genų antisens genai blokuojantys jų
transliaciją ar dviejų grandinių RNR molekulės atpažįstamos specifinių RNR
degradazės enzimų ir yra degraduojamos.
Daugumai žemės ūkio kultūroms pavojingų virusų genai identifikuoti ir jų sekos
žinomos (Jeske 2004).
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai
Atsparumas vabzdžiams
Tai labiausia paplitęs GM požymis tiek žemės tiek
miškų ūkyje.
Principas: identifikuojamas ir įterpimas atitinkamam
kenkėjui nuodingo baltymo sintezę sąlygojantis
genas. Taip išvengiama ekonominių nuostolių bei
brangaus ir gamtai žalingo purškimo insekticidais.
Baltymas gali būti nuodingas ir giminingam kenkėjui.
Taip GM patirtis iš žemės ūkio buvo pritaikyti miško
medžiuose.
Genetiškai modifikuota drebulė Kinijoje:
įterpus modfiikuotą BtCRY geną Populus
tomentosa tapo atspari lapų graužikams
Sėkmingiausias pavyzdys CRY genai, identifikuoti žemės bakterijoje Bacillus thuringiensis (Bt
CRY genai) sąlygojantys kenkėjams nuodingų baltymų sintezę. CRY geną įterpus į augalus jie
tampa atsparūs kenkėjams. Naudojami ir virškinimo toksinių genai (PIN2 bulvės genas,
stabdantis proteazės sintezę). Bandymai atlikti su drebule, maumedžiu, eukaliptu, kai kuriomis
pušies ir eglės rūšimis) (Klopfenstein ir kt. 1991, Heuchelin ir kt. 1997, Sullivan ir Lagrimini
1993, Lida ir kt. 2004).
Iki 2006 m. vienintelė komerciniu būdu naudojama GM miško medžių rūšis yra Populus
tomentosa Kinijoje: įterptas vienam iš lapų kenkėjų nuodingą baltymą sintetinantis
modifikuotas CRY genas.
Jautrios vabzdžių gentys: Lepidoptera, Coleoptera, Dipytera.
Atsparumas grybinėms ligoms
Enzimai glutanazė ir chitinazė yra susiję su patogeninės grybienos
ląstelių sienelių hidrolizacija ir padidina augalo atsparumą grybinei
ligai (pvz. Cercospora bacco tabako augaluose) (Tenhaken 2004).
Antimikrobiniai peptidų (defencinų) genai ženkliai padidina
atsparumą prieš bakterijas, grybines ligas ir net virusus. Pvz.
teigiamų rezultatų davė bandymai su transgeniniais tabako augalais
su iš ridiko izoliuotu defensino genu RsAFLP2: ženklai padidėjo
atsparumas grybinėms infekcijoms. Didesnė lipidų transportavimo
peptidų LTP2 genų ekspresija transgeniniuose Arabidobsis
augaluose padidino atsparumą grybinei infekcijai (Tenhaken 2004).
Modifikuoti ribosomas deaktyvuojančių baltymų (RIP) genai su
pažeidimu indukuojamu promotoriumi deakatyvuoja tik svetimų
ląstelių ribosomas (sustabdo baltymų sintezę), ir padidina
atsparumą prieš mikrobus ir grybines ligas (bandymai su tabako
augalais) (Tenhaken 2004).
Programuotos ląstelių mirties geno ekspresija prie šio geno
prijungiant patogeno indukuojamą promotorių. Kartu su žuvusiomis
ląstelėms žūna ir patogenas (Tenhaken 2004).
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai
Gryninės ligos pakenkti
Pinus medelio spygliai.
Programuota ląstelių
žūtis (šviesūs taškai).
Atsparumas herbicidams
Įgijus atsparumą herbicidams, galima efektyviai kontroliuoti agresyvias piktžoles ir
nepageidaujamas krūmų rūšis miško želdiniuose.
Principas:
a) identifikuojamas ir įterpimas modifikuotas genas, sintetinantis tam tikrai
herbicidų klasei jautrius bet modifikuotus baltymus ir herbicido toksinai
nesijungia prie modifikuoto geno baltymų (pvz. herbicidas glifosatas
(Roundap) blokuoja baltymų triptofano, tyrosino ir fenilanino sitenzę Populus
alba, Populus trichocarpa, Eucalyptus grandis, Larix decidua ir Pinus radiata
medeliuose, herbicidas chlorosurfulonas blokuoja baltymų valino ir leucino
sitenzę Populus tremula ir Pinus radiata).
b) identifikuojamas ir įterpimas iš mikrobų
izoliuotas genas koduojantis enzimą, kuris
detoksikuoja (sugeria ir degraduoja)
herbicido toksinus (GM naudota įvairių
Populus rūšių medeliuose, Eucalyptus,
Picea abies (Ho ir kt. 1998, Bishop-Hyrley
ir kt. 2001).
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai
GM Pinus radiata atsparūs herbicidų
poveikiui (dešinėje)
Atsparumas sunkiesiems metalams
Sunkieji metalai (pvz. Cu, Zn, Ni, Cd, Hg) sudaro junginius su
azoto atomais baltymuose ir taip juos deaktyvuoja, bei
junginių su 02 pasekoje produkuoja žalingus laisvuosius
deguonies radikalus. Šie pakenkimai dažnai sukelia spyglių
ar lapų chlorozę (geltimas dėl chlorofilo netekimas) ir stabdo
augimą.
Principas: randami su atsparumu susiję genai ir stiprinamas jų
poveikis modifikuojant šiuos genus prijungiant dažniau
transkribuojamus promotorius.
Identifikuotos genų grupės:
1. Neutralizavimas per junginius su nemetalais (paprastai
jungtys su baltymais vad. paprasfitochelatinu,
metalotioneinu))
2. Sekvestracija (metalo jono prisijungimas).
3. Šalinimas iš ląstelių.
4. Biotransformacija (genų modifikacija iš bakterijų atsparių tam
tikram metalui (pvz. merA genas iš bakterijos, skaidantis
gyvsidabrio jonus).
5. Taisymas- genai atsakingi už pakenktų audinių gijimą.
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai
Pinus ir Picea medžių spygliai
pakenkti sunkiųjų metalų taršos.
Žydėjimo ir vyriško sterilumo indukcija
Medžiai be vyriškų žiedų/strobilų neskleistų žiedadulkių: (a) GM
medžiai gali būti bandomo be GM pasklidimo rizikos, (b) medžiai
sodinami miestuose, kur yra nemažai žiedadulkėms alergiškų
žmonių.
Punus sylvestris vyriški strobilai.
Principas:
(a) įterpimas ląsteles žudančių genus (pvz. Barnazės genas,
degraduojantis visas RNR) su žiedinių struktūrų genų promotoriais
(bandymai su Populus. Kitas bakterijos rastas genas Barstar yra
Barnazės inhibitorius ir naudojamas kontroliuoti jo ekspresiją
(b) su žiedinių struktūrų iniciacija susijusių genų supresija ar, norint
saktinit žydėjimą, žydų formavimuisi kliudančiūų genų (FLC ar
EMF) supersija antisens metodu.
Pinus radiata, Arabidobsis, Betula pendula, Ecalyptus, Populus
rūšyse identifikuoti žiedų iniciacijoje dalyvaujantys ir vyriškų
strobilų formavimo genai ir jų promotoriai (pvz. LEAFY, PrCHS1 ir
PrCHS2 ekspresijos tyrimai ir cDNR sekos, Walden ir kt. 1999).
Ankstyvo žydėjimo įjungimas: padidinta LEAFY geno ekspresija su
CaMV35S promotoriumi indukavo ankstyvą Arabidopsis žydėjimą.
Bandomos rūšys: Eucalyptus, Populus, Betula. Skinner ir kt.
Mellan ir kt 2001, Lemmetyinen ir Sopanen 2004.
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai
LEAFY Geno atsakingo už strobilų
formavimą
ekspresija drebulės pumpure
2000,
(šviečiantis markerinis genas uidA.
Atsparumas aplinkos stresams (1)
Atsparumo tokiems stresams kaip sausra ar šaltis požymiai yra kompleksinės
daugelio genų sinergetinės veiklos pasekmės. Todėl, norint pasiekti rezultatų,
reikia skaidyti šiuos kompleksinius požymius.
Išskiriamos tokios atsako į stresą kategorijos: (a) greita reakcija (šalinami
tiesioginiai pakenkimo padariniai; atsako sistemos panašios tarp rūšių), (b)
pokyčiai, kad pasiekti naują metabolizmo pusiausvirą, esant stresui (pvz.
uždaryti stomatas esant dehidracijai), (3) ilgalaikiai vystymosi pokyčiai.
Atsako į stresą strategijos: dehidracija, šaltis, karštis, druskingumas stresopajautimas ir signalo perdavimas (Oksman-Caldentey ir Bardz 2004.)
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai
Pavasarinių šalnų pakenkti Picea abies
genotipai bandomuosiuose želdiniuose.
Atsparumas aplinkos stresams (2)
Miško medžių modifikacijos ir tyrimų kryptys:
Genų ekspresijos tyrimų principas: pušies
pumpuro (a) ir vegetatyviniai (b) audiniai
1. Skatinti metabolizmą, įterpiant aktyviau
a)
transkribuojamas atsakingų genų kopijas ar kelias
geno kopijas (pvz. spartesnis augimas per azoto
asimiliacijos efektyvumo padidiną (tyrimai su Picea ir
Populus, Gallardo ir kt. 1999) ar osmotinio slėgio
reguliavimas ksilemos tracheidėse.
2. Streso signalo perdavimo sistemos efektyvumo
didinimas (pvz. atsakas į dehidraciją ir vaksinių
junginių sintezė lapo epidermyje, ar stomatų
uždarymo greitis ir standumas; stiebo ir spyglių
lignifikacijos greitis atsake į žemesnes temperatūras,
atsako į fotoperiodo pokyčius greitis; pagrinde su
signalinių molekulių (giberelinas, ABA rūgštis,
etilenas, citokininai ir kt.) sinteze susiję genai.
3. Ekspresijos tyrimai ir skirtingai ekspresuotų DNR
analizė bei susijusių genų identifikacija (atsako į
stresą tyrimai klimatinėse kamerose, cDNR analizės
ir EST žymenų kūrimas).
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai
b)
Išreikšta
iRNA
cDNA
DNR
microgardelės:
hibridizacija su
žinomų genų
dalimis
GM tyrimai su miško medžiais
Su genetine modifikacija susijusių
tyrimų pasiskirstymas pagal miško
medžių gentis (FAO 2004).
4.3. Miško medžių genetinės inžinerijos pasiekimai
Su genetine modifikacija susijusių
tyrimų pasiskirstymas pagal
genetinės modifikacijos tikslus
(FAO 2004).