Transcript 4.2. Genetinės inžinerijos metodai Išskiriami 4 pagrindiniai genetinės inžinerijos etapai: 1. 2. 3. 4. DNR izoliavimas. Geno izoliavimas ir klonavimas. Geno modifikacija. Transformacija (geno perkėlimas). Tolesnė selekcija 4 pagrindiniai etapai 2.

4.2. Genetinės inžinerijos metodai
Išskiriami 4 pagrindiniai genetinės inžinerijos etapai:
1.
2.
3.
4.
DNR izoliavimas.
Geno izoliavimas ir klonavimas.
Geno modifikacija.
Transformacija (geno perkėlimas).
Tolesnė
selekcija
4 pagrindiniai
etapai
2. Genų
izoliavimas ir
klonavimas
3. Genų
modifikacija
1. DNR
izoliavimas
4.2. Genetinės inžinerijos metodai
4. Genų
perkėlimas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
1) DNR izoliavimas
Ląstelės branduolyje yra chromosomos, sudarytos iš DNR
molekulės, kurioje esantys genai sąlygoja visų organizmui
reikalingų baltymų gamybą. Reikia išskirti šią DNR molekulę iš
kitų ląstelės organelių.
Supaprasti
ntina
ląstelė ir
DNR
molekulė
Genai išsidėstę išilgai DNR grandininės
(kiekvienas atitinka savitą nukleotidų seką)
Genas 2
Genas 3
Genas 1
Izoliuojama visa augalo, turinčio
pageidaujamą požymį DNR (visų
chromosomų DNR) LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 1) DNR izoliavimas (1)
Darius Danusevičius
1. Augalo audiniai užšaldomi skystu azotu ir sutrinami,
taip suardant ląstelių sieneles.
2. Sutrinti audiniai ištirpinami druskingame
tirpale ir centrifuguojami: tirpalas sluoksniuojasi
ir DNR, RNR ir kitos sunkesnės molekulės
nusėda mėgintuvėlio dugne.
3. Įpylus organinio tirpiklio (pvz. fenolis),
ištirpsta prie DNR ir RNR prisijungę baltymai;
įpylus vandens su pamaišius, tirpalas
sluoksniuojasi: tirpiklis su baltymais nusėda,
palikdamas DNR ir RNR molekules viršutiniame
sluoksnyje.
4. Paveikus tirpalą ribonukleazės enzimu
degraduodama RNR, o įpylus alkoholio, DNR
molekulės koncentruojasi taip yra išsiskirdamos
iš tirpalo.
DNR
Genas
kurį reikia
izoliuoti
(tikrovėje
nėra
matomas
plika
akimi)
5. DNR izoliuojama ir laikoma pastovaus PH
tirpale
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 1) DNR izoliavimas (2)
Darius Danusevičius
2a) Genų izoliavimas
Vizualiai išskirti genų neįmanoma. Sudaromos genų
bibliotekos= skirtingų DNR dalių (~geno dydžio) patalpintų
bakterijose kartotekos.
1. Į kolbą įdėtos restriktazės
(“kerpantieji” enzimai)
“sukarpo” DNR molekules į
~geno dydžio dalis.
Restriktazės
karpančios DNR į
geno dydžio dalis
Dominantis genas
“Kerpantieji” enzimai- tai spec. baltymai, kerpantys DNR grandinę
tam tikroje nukleotidų sekos vietoje – pvz. C †AATTC
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 2) Genų izoliavimas (1)
Darius Danusevičius
3. Tirpalas su DNR atkarpomis
įpilamas į tirpalą su bakterijų
plazmidėmis (spec.DNR), kurios iš
anksto sukarpytos tų pačių enzimų
pagalba ir specialiai modifikuotos,
įterpiant antibiotikams atsparų geną.
Bakterijos turi 2 DNR tipus:
“pastovi” ir “migruojant”
(vad. plazmidė), kuri
migruoja iš bakterijos ir
įsiterpia į apkrėsto
organizmo DNR.
Plazmidę sudaro keli
tūkst. genų
Migruojanti
DNR
Pastovi
DNR
4. Kadangi plazmidės DNR ir
tiriamos DNR sukarpytos tomis
pačiomis restriktazėmis
(=tinka DNR atkarpų ir
plazmidžių DNR galai), DNR
atkarpos įsiterps į plazmidės.
+
Restriktazės
sukarpyta DNR
su dominančiu
genu
=
Tos pačios
restriktazės
sukarpytos
plazmidės
Naujas
genas
Plazmidė
Plazmidė
su nauju
genu
Pastaba: genai gali įsiterpti ne į
visas plazmides, todėl reikės
patikrinimo
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 2) Genų izoliavimas (2)
Darius Danusevičius
5. Plazmidės su naujais genais
įterpiamos atgal į bakterijas
elektros šoko būdu (ląstelių
sienelės įtrūksta ir plazmidės
patenka į vidų).
Įpilamos
bakterijų
ląstelės
Elektrošokas
sienelės
atsidaro
Į dauguma bakterijų įsiterps naujos
plazmidės su naujais genais
6. Bakterijos supilamos į antibiotikų
tirpalą; kadangi buvo naudotos
7. Bakterijos dauginasi, susidaro jų
plazmidės, turinčios atsparų
antibiotikams geną, gyvos liks tik kolonijos. Kad kiekvienoje lėkštelėje būtų
naujus genus turinčios bakterijos. skirtinga DNR atkarpa, reikėtų keliolikos
Bakterijos su
1000 lėkštelių.
nauju genu
Antibiotikas
Gyvos liko tik bakterijos
su nauju genu
Bakterijos ( kartu su
naujais genais) saugomos
ir naudojamos kaip knygos
bibliotekoje. Tokie
bakterijų rinkiniai vadinami
genų bibliotekomis.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 2) Genų izoliavimas (3)
Darius Danusevičius
2b) Genų klonavimas
7. Reikia rasti kurioje kolonijoje yra norimas
genas. Tam naudojamas šį geną žymintis
molekulinis žymuo (PCR pradmenys iš abiejų
geno pusių ar hibridizacijos markeriai).
Žymenys: DNR atkarpos kurių kodas
sutampa su geno dalimi (nustatomi
sankibos grupių analizės bandymais ar
genominių duomenų bazių analizės
rezultate (cDNR, EST)).
8. Nustačius kurioje kolonijoje
yra normas genas, ši kolonija
izoliuojama ir dauginama
(klonuojama) ir tokiu būdu
paruošiama tolesniam etapui
pačio geno modifikacijai.
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 2) Genų klonavimas (1)
?
EST žymenys
Genas
Bakterijos
dauginasi
DNR
išgryninimas
Genas izoliuotas ir klonuotas tolesnei
modifikacijai
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
3) Genų modifikacija
Genus galima modifikuoti, pakeičiant jų funkcines dalis taip,
kad įterpus, genai sąlygotų pageidaujamą požymio išraišką.
Geną sudaro 3 funkcinės dalys:
Baltymai
Pradas
Koduojanti
Promotorius
Nusako, kada,
dalis
kur ir kiek
baltymo gaminti
(įjungia/išjungia)
Nusako kokį
baltymą gaminti
Promotorius (liet. prado) dėka pvz.
žievės ląstelėse nėra išreikšti žiedams
reikalingi baltymai (nors žiedų genai
yra visur).
Pabaigos
dalis
Sąlygoja kodo
nuskaitymo pabaigą
(=toliau kitas genas)
a)
b)
Genui pakeičiama koduojanti dalis
Baltymas
DNR
Aminorūgštys
Aminorūgštys
Aminorūgštys
Trijų nukleotidų raktas (kodonas) koduoja atitinkamą
aminorūgštį, kurių rinkinys sudaro baltymą.
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 3) Genų modifikacija (1)
Pav. parodytos 3
skirtingos koduojančios
dalys, o pasekoje
pasikeičia baltymo aminorūgščių sudėtis (pažymėta
spalvotos figūromis)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Prieš atliekant geno modifikacija reikalingas planavimas:
a) Kada reikia norimo baltymo? (promotorius).
b) Kur riekia norimo baltymo? (promotorius).
c) Kiek norimo baltymo reikia? (promotorius).
d) Kokio baltymo reikia? (koduojanti dalis).
Reikia parinkti tikslinius geno promotoriaus ir
koduojančios dalies derinius.
Pvz. jei norima modifikuoti organizmą įterpiant
tam tikram kenkėjui nuodingą baltymą koduojantį
geną, reikia įvertinti: ką ir kada valgo kenkėjai?
kiek nuodingo baltymo reikėtų? (jei per > tai be
reikalo naudotų išteklius).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 3) Genų modifikacija (2)
Darius Danusevičius
Problemos pavyzdys. Pastebėta, kad dirvos bakterijos genas
Bt CRYA gamina baltymus nuodingus kenkėjams. Tačiau
perkėlus bakterijos geną į augalą, jo pradas netiks ir
neįjungs geno = reikia pakeisti pradą.
Pvz. gali būti naudojami du žinomi genų
pradai- 35S, ir PEP:
• 35S pradas gautas iš tam tikro viruso ir
aktyvuota genus visose ląstelėse (gali
įjungti bet kokį geną bet kur), todėl
įterptas genas veiks visame organizme
visus metus.
• PEP pradas gautas iš fotosintezėje
dalyvaujančio geno. Jis veiks tik
“žaliuose” audiniuose ir tik šiltojo
sezono metu.
Kenkėjui
nuodingas
baltymas
Išreikštas visuose audiniuose
Išreikštas žaliuose audiniuose
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 3) Genų modifikacija (3)
Darius Danusevičius
1.Restriktazės iškerpa iš
plazmidės reikiamą geną.
2. Kitos restriktazės
sukarpo geną į
funkcines dalis.
Modifikuotas
genas
3.Įdedamos naujos geno
dalys, kurių dalis
prisijungia prie likusios
modifikuojamo geno dalies.
Bakterija
4. Įdedamos naujos su attinkamais enzimais
sukarpytos plazmidės, į kurias įsiterpia
modifikuotas genas. Plazmidės įterpiamos į
bakterijų bibliotekas.
5. Bakterijų kolonijos su modifikuotu
genu dauginamas ir saugojimas iki
kito etapo – geno perkėlimo
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 3) Genų modifikacija (4)
Darius Danusevičius
Genų modifikacijos pavydžiai:
(1) Įterpiamas kenkėjui
nuodingas genas,
(2) Roundup’ui atsparus
genas = galima purkšti,
(3) Padidinti pageidaujamų
junginių kiekį (pvz. sojų
maistingumą ar vitamino A
kiekį ryžių endosperme).
(4) Lignino modifikacija
medienoje: įterpiamas genas
slopinantis liginio sintezę, taip
sumažinant celiuliozės
išskyrimą apsunkinančio
lignino kiekį ląstelėse.
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 3) Genų modifikacija (5)
Medvilnės daigas be
Bt geno (pakenktas
kenkėjų)
Medvilnės daigas
su Bt genu
(sveikas)
Atsparumas
roundap’ui
Mažiau
lignino
medienos
ląstelėse
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
4) Transformacija
Transformacija tai naujo geno yra įterpimas į ląsteles, iš kurių
išauginamas naujas augalas.
1. Genai įterpiami į funkcijų neįgijusias ląsteles (kaliusą)
bakterijų, dalelių bombardavimo ar elektros impulsų pagalba.
2. Audinių kultūros metodai leidžia iš šių ląstelių (audinių)
išauginti naują augalą.
Genas
Įterpimas
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 3) Transformacija (1)
Augimas
Naujas genas
visose ląstelėse
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Geno įterpimo sunkumai:
•Genas turi patekti būtent į
chromosomas.
?
•Po įterpimo ląstelės turi likti
gyvos.
Genas
•Kaip identifikuoti kuriose ląstelėse
genas įsiterpė?
•Turi būti parinktos specialios
ląstelės (kaliusas), kurios gali
išaugti į naują augalą,
•Naujas genas neturi įsiterpti į
esančio geno dalį, bet jį pilnai
pakeisti.
Genas N
Genas 1
Genas 1
Genas2
Genas N
Genas 3
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 3) Transformacija (2)
Darius Danusevičius
Bakterijų metodas
Kaliuso audiniai laikomi tirpale su bakterijomis, kurios įterpia
savo plazmides į kaliuso ląstelių branduoliuose esančias
DNR molekules.
Bakterijos turi 2 DNR tipus:
“pastovi” ir “migruojant”
(vad. plazmidė), kuri
migruoja iš bakterijos ir
įsiterpia į apkrėsto
organizmo DNR.
Plazmidę sudaro keli
tūkst. genų
Migruojanti
DNR
Pastovi
DNR
Privalumai - tai natūralus metodas, bakterija pati įterpia savo
plazmidę kartu su nauju genų į įterpimui tinkančia DNR
molekulės vietą (bus išvengta problemų kai genas įterpiamas
ne į branduolį ar viduryje kito geno, kas sutrikdo jo veiklą)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 3) Transformacija (3)
Darius Danusevičius
Kiti įterpimo būdai
Tikslas įterpti naują geną su jį identifikuoti leidžiančiu
markeriniu genu į ląstelės branduolį jos nepažeidžiant.
Įterpimo sėkmę lemia bandymų skaičius, t.y didelis
skaičius įterpimo bandymų lemia didesnę sėkmę.
Aukso
dalelė su
geno
kopijomis
helis
Genų patranka. Mikroskopinės aukso dalelės
padengiamos 100-tais geno kopijų išaunamos kaliuso
ląsteles. Principas- vaakumo, kameroje dalelės iššaunamos
į aukšto slėgio dujomis.
Kaliuso ląstelės
Branduolio terpėje genai pasklinda
ir įsiterpia į chromosomas
Minusas – genas gali įsiterpti bet kur ir
kelis kartus vienoje vietoje.
Genų patranka
Audinių kultūraaugalo
išauginimas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 3) Transformacija (4)
Darius Danusevičius
Transformacijos kontrolė
•Koks genas buvo įterptas?
•Kur jis buvo įterptas (kokioje
chromosomos dalyje)?
•Kiek jo kopijų buvo įterpta?
Gali įsiterpti bet kurioje dalyje ir bet kurioje
chromosomoje
Buvęs tam tikras genas
Gali įsiterpti į jau esančio geno vidurį ir
taip nutraukti jo veikimą
Gali įsiterpti kelios geno kopijos, todėl
organizmas pats gali šį geną “išjungti”.
Įsiterpęs naujas genas
Įsiterpė kelios geno kopijos
Išeitis: išbandyti daug GMO augalų ir atrenkami tik sveiki turintys
modifikuotą požymį (pvz. iš 1000 vnt.- 1 vnt.)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 3) Transformacija (5)
Darius Danusevičius
5) GM augalo išauginimas.
Audinių kultūra
Audinių kultūra tai augalo išauginimas
dirbtinėje aplinkoje (in vitro) iš izoliuotų
ląstelių grupės (audinio).
Ląstelės iš įvairių augalo dalių (pvz.
iš gemalo užuomazgos), įdedamos į
lėkštę, kur esanti terpė neturi
augimo hormonų, “įsakančių” į kokį
audinio tipą joms vystytis.
Ląstelėms dalinantis, susiformuoja
specifinės funkcijos neatliekančių
ląstelių masė, vadinama kaliusu.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (1)
Darius Danusevičius
Kaliuso ląstelės turi visą naujo augalo
išauginimui reikalingą genetinę informaciją,
Įdėjus tam tikrus jų transformaciją į gemalų
ląsteles sąlygojančius augimo hormonus ir
paveikus tam tikru temperatūros ir šviesos
rėžimu, išauginamas naujas gemalas +
gemalų genezė = daug gemalų išaugančių į
augalus
Augalo dalys, iš
kurių gali būti
paimti audiniai
mikrodauginimui
Ūgliu ir šaknų diferenciacija kaliuse.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (2)
Darius Danusevičius
Somatinė gemalų genezė
•Alternatyva audinių kultūrai organogenzės būdu
yra somatinė gemalų genezė- tai vegetatyvinio
mikro-dauginimo metodas kai gemalai išauginami
iš vegetatyvinių ar negametinių audinių.
•Manipuliuojant maitinimo terpėmis ir aplinkos
sąlygomis, indukuojama audinių profiliacija į
gemalų pirmines ląsteles, kurios gali būti
užšaldomos skystame azote neribotam laikui.
P. pušies somatinės gemalų genezės
stadija (Miškų institutas, Švedija )
•Norint genotipus klonuoti, šioms gemalų
pirminėms ląstelėms indukuojamas augimas į
gemalus, kurie apvelkami dirbtiniu maisto
medžiagų sluoksniu ir taip paverčiami į dirbtines
sėklas
•Dirbtinės sėklos auginamos įprastu būdu į
medelius medelynuose (pigu).
Somatiniai sitkinės eglės
gemalai
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (3)
Darius Danusevičius
Tam, kad atskirti kaliuso ląsteles su nauju genu, naudojami molekuliniai
žymenys (ar specialios fluorescencinės molekulės), kurie įterpiami į naujus
genus turinčias bakterijų plazmides ir taip patenka į augalo ląsteles kartu su
naujuoju genu.
Chromosoma
Bakterijos turi 2 DNR tipus:
“pastovi” ir “migruojant”
(vad. plazmidė), kuri
migruoja iš bakterijos ir
įsiterpia į apkrėsto
organizmo DNR.
Plazmidę sudaro keli
tūkst. genų
Įterptas
genas
Bakterija
Migruojanti
DNR
Pastovi
DNR
Žymuo
Žymuo gali būti atsparumą
antibiotikams turintis genas,
tada kaliuso ląstelės
paveikiamos antibiotikais ir
atrenkamos tik gyvi audiniai.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (3)
Darius Danusevičius
Alternatyvos audinių kultūrai
Audinių kultūros problema- tinkamos terpės ir hormonų
parinkimas, kurie gali skirtis tarp rūšių ir genotipų.
Alternatyvos
– genų įterpimas į lytinių organų pradines
ląsteles, kurios išsivystys į žiedadulkes ar
kiaušides. Šių augalų sėkliniai palikuonys
turės naujus genus.
-genų įterpimas tiesiai į žiedadulkes,
-žiedų “mirkymas” skystyje su
modifikuotomis bakterijomis
(perspektyviausias).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
4.2. Genetinės inžinerijos metodai: 5) GM augalo išauginimas (4)
Darius Danusevičius