Transcript 3.6 Genų identifikacija ir funkcijos nustatymas, genolapiai V.Baliuckas Genetikos ir selekcijos skyrius Tam tikras pozicinio klonavimo taikymo kartografuojant, pvz.

3.6 Genų identifikacija ir funkcijos
nustatymas, genolapiai
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Tam tikras pozicinio klonavimo taikymo kartografuojant, pvz. žmogaus, genus
būdas yra vadinamasis ‘kandidatinių genų’ metodas. Šiuo atveju nustatoma tam
tikro požymio fenotipo sankiba su konkrečiu chromosomos regionu, kuriame jau
anksčiau buvo surastas kokį nors baltymą koduojantis genas. Belieka vieną ar
kelis genus, esančius tame chromosomos regione, susieti su tiriamo požymio
fenotipu.
Kandidatinių genų
identifikavimas
Kandidatiniai genai
KandidaSusietumo tyrimai
tinio geno tarp kandidatinio geno polimorpaieška fizmo ir požymio variacijos
Kandidatinio
geno tikrinimas
V.Baliuckas
Genolapių
sulyginimas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Genolapių segregacija
tarp kandidatinio geno žymens ir
lokuso apsprendžiančio požymio
variaciją (QTL)
Fiziologinė
analizė
Genetinė
transformacija
C.Plomion_CD material_2002
Silpniausia grandis, kadangi
reikalingi ilgalaikiais eksperimentais
paremti duomenys
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
http://www.stats.ox.ac.uk/~hein/HumanGenome/cardon.pdf
Apytiksliai 30 000 genų
pas aukštesniuosius augalus
Genai atsakingi už sausros streso atsaką ir,
dar svarbiau, už atsparumą
Genomas
išreikštas genomas
mRNR
DNR
1/ Geno seka
V.Baliuckas
Adaptacija
Baltymai
2/ mRNR ir baltymo
sukaupimas
Genetikos ir selekcijos skyrius
C.Plomion_CD material_2002
Kandidatiniai genai būna:
• Funkciniai kandidatiniai genai
(žinomi genai, modelinės rūšys)
• Išraiškos kandidatiniai genai
1/ išreikšti tam tikrose augalo dalyse bei
vystymosi stadijose
2/ išreikšti tam tikromis sąlygomis
normaliai
drėkinama
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
nelaistoma
C.Plomion_CD material_2002
1/ išreikštumas tam tikruose audiniuose
ksilema
18%
25%
22%
šaknys
žiedadulkės
pumpurai
Baltymai
7.2%
45%
12.5%
83%
8%
12%
2%
1%
7.6%
35%
10.6%
spygliai
spygliai
Spec. ksilemos ir
šaknų baltymų profiliai
mRNR
• Ksilemos EST duomenų bazėse (70 000 P. taeda + 10 000 P. pinaster)
• Šaknų EST (20 000 P. pinaster)
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
C.Plomion_CD material_2002
2/ genai išreikšti tam tikromis sąlygomis
« identifikacija genų atsako sausrai »
MEDIENA (savybės)
Tyrimai
• cDNR-AFLP
Metodika
• rendomizuotas EST
sekvenavimas
• genų išraiškos profiliavimas
6 medienos tipai
10,000 ksilemos EST iš
cDNR bibliotekos
(6 medienos tipai, 6 genotipai)
SAUSRA
du bandymo režimai:
-normalaus drėkinimo
-sausros imitacijos
EST
(šaknys ir spygliai)
Transkriptomika ir proteomika
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
C.Plomion_CD material_2002
Suktaspyglės pušies (Pinus contorta) pridėtinių šaknų vystymosi (Brinker et al.
2004) tyrimams buvo parinkta 2178 cDNR sekos iš Pinus taeda cDNR bibliotekų. Viena
iš dvylikos cDNR kategorijų buvo parinkta pagal jų funkciją, naudojantis homologinėmis
sekomis iš Arabidopsis genomo bibliotekos.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
A – 4 savaičių pušies hipokotilis (poskiltis), B – skersinis
hipokotilio pjūvis įvairiose vystymosi fazėse
Skirtingai pasireiškusių
atskirose pridėtinių šaknų
vystymosi fazėse genų
skaičius
220 ekspresuotų genų
pasireiškimas, skirstant juos į
dvi grupes pagal ekspresiją
atskirose šaknų vystymosi
fazėse
220 genų transkripcijos lygis
žymiai padidėjo ar sumažėjo ir
daugumos (183 iš 220) jų
ekspresija pasikeitė skirtingose
šaknų vystymosi stadijose.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
EST mikrogardelių metodu galima tirti su medžių lytine branda susijusius genus
(Campbell et al. 2003). Yra žinoma, kad potencialių reguliacinių genų ekspresija labai
skiriasi skirtinguose augalo audiniuose, skirtingose vystymosi stadijose ir įvairiose
aplinkos sąlygose.
Fotoperiodizmas augaluose
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Miško medžių rūšių domestikacija
EST ar genomo sekos
Mikrogardelių ekspresijos studijos
Kandidatinių genų identifikavimas
Funkcinė analizė panaudojant
transgeninius medžius (galimai)
Fenotipinė analizė panaudojant
lauko ar šiltnamio bandymus
Genetinio atsako tikslinimas
Selekcionuoti varietetai, selekcija
genų pagrindu (GAS)
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Dauguma aukštesniųjų organizmų turi
genome vidutiniškai apie 30 000 genų.
Tik mažos jų dalies funkcijos yra
žinomos.
• Funkciniai kandidatiniai genai
(žinomi genai, modelinės rūšys)
Modeliniai genomai ir modelinės rūšys ar organizmai:
Kas apsprendžia modelinio genomo tinkamumą?
• Genomas turi būti nedidelis ir neturėtų būti daug kartotinių sekų
• Eukariotuose: diploidinis genomas yra tinkamas genetinių kryžminimų sekimui
Kas apsprendžia modelinės rūšies ar organizmo tinkamumą?
• Techninės priemonės ir metodai genetinėms manipuliacijoms atlikti (transformacijos,
mutacijos, genų klonavimas ir pan.)
• Išauginimo ir dauginimo laboratorijos sąlygomis paprastumas
• Sąlyginai trumpas vienos generacijos laikas
• Modelinis organizmas turi būti artimas tiriamajam
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
http://www.genetik.uni-bielefeld.de/~/Genome_Research_WS2005_06/
Populus yra viena iš modelinių rūšių svarbių miškininkystei
Dabartiniu metu didelis dėmesys skiriamas eukalipto sekvenavimui ir EST duomenų
bazės kūrimui
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
http://www.genetik.uni-bielefeld.de/~/Genome_Research_WS2005_06/
Ar genetinė transformacija visada yra įgyvendintina?
• Genetinė transformacija yra efektyvi tuopoms:
– stabili transgeninė ekspresija, maža somakloninė variacija
• Svarbiausias medžių rūšis yra sunku genetiškai transformuoti ir regeneruoti:
– svarbių reguliatorinių genų reikšmę sunku interpretuoti pagal modelinių rūšių
transformacijas
• Tyrimai transformacijos srityje yra labai svarbūs genominei medžių biologijai:
– efektyvumas, reguliavimas, saugumas
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
http://gcep.stanford.edu/pdfs/energy_workshops_04_04/
UniGene yra eksperimentinė sistema automatizuotai suskirstanti Genų banko
(GenBank) sekas į genams priskiriamus klasterius. Kiekvienas UniGene klasteris talpina
sekas būdingas atskiram genui, taip pat papildoma aktuali informacija apie audinių
kultūrą, kurioje genas buvo išreikštas, ir vietą genolapyje.
UniGene bazėje yra 72 rūšys (2006 metų pradžios duomenys), visoms šioms rūšims
surasta daug išreikštų genų sekų (EST).
Susiję su UniGene duomenų bazės: Gene, HomoloGene, dbEST, Trace Archive.
Nedidelis kiekis išnykusių gyvūnų rūšių (pvz, mamuto, kardadančio tigro) DNR sekų taip
pat yra padėta Genų Banke.
Rūšis
Unigene klasteriai
Picea glauca
6,867
Picea sitchensis
6,907
Pinus taeda
14,198
Pinus taeda
Malus x domestica
17,180
14 198
iš viso rinkinių
Populus balsamifera
11,310
89
rinkiniai talpinantys bent vieną RNR
Populus tremula x
Populus tremuloides
7,641
14 188
rinkiniai talpinantys bent vieną EST
79
rinkiniai talpinantys ir mRNR ir EST
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
229 620 viso sekų klasteriuose
Pirmi 20 organizmų dbEST duomenų bazėje (2002 metų duomenys)
Organizmas (rūšis)
EST klasteriai
Homo sapiens (žmogus)
Mus musculus (pelė)
Rattus norvegicus (žiurkė)
Drosophila melanogaster (vaisinė muselė)
Glycine max (soja)
Bos taurus (jautis)
Danio rerio (žuvų rūšis)
Xenopus laevis (varlių rūšis)
Caenorhabditis elegans (nematodas)
Lycopersicon esculentum (pomidoras)
Zea mays (kukurūzas)
Medicago truncatula (žolinis augalas)
Arabidopsis thaliana (žolinis augalas)
Chlamydomonas reinhardtii
Hordeum vulgare (miežiai)
Oryza sativa (ryžiai)
Sus scrofa (kiaulė)
Anopheles gambiae (moskitų rūšis)
Ciona intestinalis (moliuskų rūšis)
Sorghum bicolor (sorgas)
4,070,035
2,522,776
326,707
255,456
234,900
230,256
197,630
197,565
191,268
148,338
147,658
137,588
113,330
112,489
104,803
104,284
103,321
88,963
88,742
84,712
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Pontius et al. 2003
Pavy et al. 2005
Daugumos medžių rūšių ypatumai:
• Didelė požymių morfologinė variacija
• Ilgaamžiškumas
• Ribotas eksperimentinių kryžminimų kiekis
• DNR variantų 5 kartus daugiau nei žmogaus genome
• Nedideli tarppopuliaciniai skirtumai
• Neatsitiktinė genų sankiba (angl. linkage disequilibrium) ~1500 bp (Brown et al. 2004)
http://www.woodwisdom.fi/content/Events/Forest_Biotechnology_Seminar01022006/
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Žmogaus ir medžių genolapių sudarymas
Išvengiama dirbtinio
kryžminimo
Populiacijų duomenys su
besiskiriančiais fenologiniais
duomenimis
Istoriškai susiklosčiusi
mažiau sudėtinga medžių
rūšių populiacinė struktūra
Medžiams būdinga daug
mažesnė neatsitiktinė genų
sankiba (tai leidžia
identifikuoti mažesnes DNR
sekas susijusias su
fenotipiniu požymiu)
Medžių tyrimai turi būti
grindžiami kandidatinių
lokusų analize
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
J.N. Hirschhorn and M. Daly (2005)
a) Tiesioginis susiejimas atskiro polimorfinio nukleotido
(SNP) su fenotipiniu požymiu;
b) Netiesioginis susiejimas atskiro polimorfinio nukleotido
(SNP) su fenotipiniu požymiu, pasinaudojant
neatsitiktine genų sankiba (angl. linkage
disequilibrium).
Žmogaus tyrimai gali naudoti
neatsitiktinę genų sankibą ir susietas
DNR sritis ar vietas, nepriklausančias
tam pačiam genui.
Medžių tyrimuose turi būti naudojamos
DNR sritys to paties geno ribose
Neale and Savolainen (2004)
Šešta grupė
Quercus robur genolapiai
Ąžuolo genolapiai buvo sudaryti
panaudojant 271 RAPD, 10 SCAR,
18 SSR, 1 minisatelitinį, 6 enzimų ir 1
5S rDNA žymenį. Buvo tiriami 94
medžiai iš sibų šeimų.
Šie genolapiai bus panaudoti molekuliniams tarprūšinės ir vidurūšinės ąžuolo rūšių
diferenciacijos tyrimams, o taip pat adaptyvinių požymių QTL identifikavimui.
Barreneche et al. (1998)
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
http://www.pierroton.inra.fr/genetics/labo/
Eucalyptus urophylla ir E. grandis genolapiai
Genolapiai, sudaryti panaudojant tarprūšinę hibridizaciją, pasitarnaus identifikuojant
kandidatinius genus, pavyzdžiui, medienos savybių (lignifikacijos) QTL nustatymui.
Plačiau aprašyta Cervera et al. 2000.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Gion et al. 2000
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
http://www.pierroton.inra.fr/genetics/labo/
Taip vadinami inkariniai lokusai (angl. anchor loci) panaudojami sudarant bendrą, pvz.
pušų, genolapį, kuris gali būti panaudotas giminingų rūšių genomų struktūros ir
evoliucijos tyrimams.
Viena iš dvylikos genolapio sankibos grupių
(LG1), sudaryta pagal Pinus contorta
polimorfinių išreikštų genų sekų (ESTP)
inkarinius lokusus. Sėkminga PGR amplifikacija
atitinkamose pušies rūšyse pavaizduota
apskritimais: užpildyti parodo lokuso
polimorfiškumą, o neužpildyti –
monomorfiškumą.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
G. R. Brown et al. 2001
Paveldėjimo ir genolapių sudarymo studijos plikasėklių augalų rūšims
(01/2004 duomenys)
Žymenų
tipas
Rūšys
Tirta
Tyrimo objektas
Morfologiniai
Ginkgo biloba
Paveldėjimas
Laisvo apsidulkinimo šeimos
Izoenzimai
Pinus rigida, Pinus
sylvestris, Pinus
ponderosa,
Pseudotzuga
menziesii,
Pinus banksiana,
Pinus attenuata,
Pinus thungergii,
Paveldėjimas
Laisvo apsidulkinimo šeimos
Pinus taeda
Genetinis
kartografavimas
Trijų generacijų (kartų)
kryžminimai
Baltymų
V.Baliuckas
Cryptomeria japonica Genetinis
kartografavimas
F2 savidulkinės šeimos
Pinus pinaster
Laisvo apsidulkinimo, F2
savidulkinės šeimos, arba abu
objektai kartu
Genetikos ir selekcijos skyrius
Genetinis
kartografavimas
http://www.pierroton.inra.fr/genetics/labo/
Žymenų
tipas
Rūšys
Tirta
Tyrimo objektas
RFLP
Pinus taeda,
Pseudotsuga
menziesii
Paveldėjimas
Trijų generacijų (kartų)
kryžminimai
Pseudotsuga
menziesii, Pinus
radiata, Cryptomeria
japonica, Larix
kaempferi
Genetinis
kartografavimas
Trijų generacijų (kartų)
kryžminimai
Cryptomeria japonica,
Larix kaempferi
Genetinis
kartografavimas
Sibų ar pusiausibų šeimos
RAPD
V.Baliuckas
Pinus pinaster,
Genetinis
Pseudotsuga
kartografavimas
menziesii, Picea
glauca, Pinus elliottii,
Pinus contorta, Picea
abies, Pinus sylvestris,
Pinus strobus, Pinus
radiata, Larix decidua
ir kt.
Genetikos ir selekcijos skyrius
Trijų generacijų (kartų)
kryžminimai, F2 savidulkinės
šeimos, laisvo apsidulkinimo,
sibų ar pusiausibų šeimos
http://www.pierroton.inra.fr/genetics/labo/
Žymenų
tipas
RAPD
AFLP
V.Baliuckas
Rūšys
Tirta
Tyrimo objektas
Pseudotsuga
menziesii, Picea
abies, Pinus
sylvestris, Pinus
nigra, Pinus brutia,
Pinus leucodermis
Paveldėjimas
Trijų generacijų (kartų)
kryžminimai, laisvo
apsidulkinimo ar sibų šeimos
Picea abies, Pinus
Genetinis
taeda, Pinus
kartografavimas
pinaster, Pinus
edulis, Larix
kaempferi, Larix
decidua, Cryptomeria
Japonica, Pinus
thunbergii, Pinus
sylvestris, Pinus
contorta, Pinus
elliottii x Pinus
caribaea,
Trijų generacijų (kartų)
kryžminimai, F2 savidulkinės
šeimos, laisvo apsidulkinimo ar
sibų šeimos
Picea abies
Laisvo apsidulkinimo šeimos
Genetikos ir selekcijos skyrius
Paveldėjimas
http://www.pierroton.inra.fr/genetics/labo/
Žymenų
tipas
Rūšys
Tirta
Tyrimo objektas
SSR
Picea abies, Pinus
strobus, Pinus
pinaster, Pinus
radiata,
Genetinis
kartografavimas
Trijų generacijų (kartų)
kryžminimai, laisvo
apsidulkinimo, sibų ar
pusiausibų šeimos
Picea abies, Pinus
taeda
Paveldėjimas
Laisvo apsidulkinimo ar sibų
šeimos
STS - EST
V.Baliuckas
Pinus pinaster, Pinus Genetinis
sylvestris, Pinus
kartografavimas
strobus, Pinus taeda,
Pinus radiata,
Cryptomeria
japonica, Pinus
contorta
Trijų generacijų (kartų)
kryžminimai, F2 savidulkinės
šeimos, laisvo apsidulkinimo,
sibų ar pusiausibų šeimos
Pinus pinaster, Pinus
sylvestris, Pinus
taeda, Pinus radiata,
Picea mariana
Trijų generacijų (kartų)
kryžminimai, laisvo
apsidulkinimo ar sibų šeimos
Genetikos ir selekcijos skyrius
Paveldėjimas
http://www.pierroton.inra.fr/genetics/labo/
Kandidatinių genų identifikavimo metodas taip pat turi trūkumų,
taikant jį augalų genetiniuose tyrimuose:
-tiriamus požymius sąlygojantys fiziologiniai procesai dažnai yra mažai ištirti ir tai riboja
kandidatinių genų parinkimą
-fiziologinių procesų skaidymas į atskirus etapus būtų optimalus būdas, tačiau ne
visada tą yra įmanoma atlikti
-kuo daugiau kandidatinių genų/lokusų yra nustatoma genolapiuose, tuo didesnė
tikimybė, kad ko-segregacija gali pasitaikyti tiesiog atsitiktinai
-detali sankibos grupių analizė gali būti atlikta tik didelėje populiacijoje tam, kad
patikrinti ir pagrįsti kandidatinį geną.
Daugėjant duomenų EST bazėse ir atsirandant naujų mikrogardelių metodų,
vis daugiau kandidatinių genų bus galima identifikuoti.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Pflieger et al. 2001
Literatūros sąrašas
Barreneche T, Bodénès. C, Lexer C, Trontin J F, Fluch S, Streiff R , Plomion C, Roussel G,
Steinkellner H, Burg K, Favre JM, Glössl J and Kremer. A. 1998. A genetic linkage map of Quercus
robur L. (pedunculate oak) based on RAPD, SCAR, microsatellite, minisatellite, isozyme and rDNA
markers. Theor Appl genet 97: 1090-1103.
Brown G.R., Gill G.P., Kuntz R.J., Langley C.H. and Neale D.B. 2004. Nucleotide diversity and
linkage disequilibrium in loblolly pine. PNAS 101 (42): 15255–15260.
Brown GR., Kadel EE. III, Bassoni DL., Kiehne KL., Temesgen B., Buijtenen JP. van, Sewell MM.,
Marshall KA., Neale DB., van Buijtenen JPAD 2001. Anchored reference loci in loblolly pine (Pinus
taeda L.) for integrating pine genomics. Genetics, 159 (2): 799-809.
Campbell M.M.,Brunner A.M., Jones H.M. and Strauss S.H. 2003. Forestry’s fertile crescent: the
application of biotechnology to forest trees. Plant Biotechnology Journal 1:141-154.
Cervera MT., Plomion C., Malpica C. 2000. Molecular markers and genome mapping in woody
plants. In : Jain SM and Minocha SC (eds.), Molecular Biology of Woody Plants, Volume 1, Kluwer
Academic Publishers, The Netherlands. Pp.:375-394.
Gion J-M., Rech P., Grima-Pettenati J., Verhaegen D., Plomion C. 2000. Mapping candidate genes
in Eucalyptus with emphasis on lignification genes. Mol Breed 6: 441-449.
Neale DB. and Savolainen O. 2004. Association genetics of complex traits in conifers. Trends in
Plant Science 9: 325-330.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Naudota literatūra
Pavy N., Paule Ch., Parsons L., Crow J.A., Morency M-J., Cooke J., Johnson J.E., Noumen E.,
Guillet-Claude C., Butterfield Y., Barber S., Yang G., Liu J., Stott J., Kirkpatrick R., Siddiqui A., Holt
R., Marra M., Seguin A., Retzel E., Bousquet J. and MacKay J. 2005. Generation, annotation,
analysis and database integration of 16,500 white spruce EST clusters. BMC Genomics 6 (144): 119.
Pflieger S., Lefebvre V., Causse M. 2001. The candidate gene approach in plant genetics: a review.
Molecular Breeding 7: 275–291.
Pontius J.U., Wagner L. and Schuler G.D. 2003. UniGene: A Unified View of the Transcriptome.
Rančelis V. 2000. Genetika. Lietuvos Mokslų Akademijos leidykla, Vilnius. Pp. 662.
Savolainen O. 2006. Genetic basis of natural variation: international projects. (ppt presentation)
http://www.woodwisdom.fi/content/Events/Forest_Biotechnology_Seminar01022006/
Steane D. 2005. Complete Nucleotide Sequence of the Chloroplast Genome from
the Tasmanian Blue Gum, Eucalyptus globulus (Myrtaceae). DNA Research 12: 215-220.
Strachan T. and Read A.P. 1999. Human Molecular Genetics. John Wiley & Sons, second edition.
Vasemägi A. and Primmer C. R. 2005. Challenges for identifying functionally important genetic
variation: the promise of combining complementary research strategies. Molecular Ecology 14:
3623–3642.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius