Transcript 3.3 Kiekybinių požymių lokusų identifikavimas

3.3 Kiekybinių požymių lokusų
(QTL) identifikavimas
3.3.1 Įvadas.
3.3.2 QTL nustatymo populiacijos sukūrimas ir fenotipiniai požymiai.
3.3.3 QTL paieškos molekulinių žymenų sistemos.
3.3.4 QTL nustatymo statistiniai metodai.
3.3.5 QTL testavimas.
3.3.6 Miško medžių QTL tyrimų apibendrinimas.
3.3.7 Kandidatinių genų paieška.
3.3.8 QTL naudojimas selekcijoje.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
3.3.1 Įvadas
• Kiekybinių požymių lokusai (ang. quantitative trait loci (QTL))tai vietos chromosomose, kuriose yra genai, sąlygojantys
kiekybinius požymius. QTL vietas žymi molekuliniai žymenys.
• Molekuliniai žymenys tai nedidelės DNR molekulės, kurių
nukleotidų sekos atitinka nukleotidų sekas, esančias geno
sudėtyje ar netoli ir paveldimos vienoje sukibimo grupėje.
Žymuo, susijęs
su QTL
• Individų atranka, panaudojant
informaciją apie genetinius
žymenų sąsajas su genais,
vadinama atranka žymenų
pagalba (angl. MAS: marker
asssisted selection)
A
QTL geno vieta
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
chromosomoje
Molekulinio žymens samprata
Molekuliniai žymenys nustatomi specialiais DNR
sukarpymo, specifinių sekų pagausimo, iRNR
klonavimo metodais, kurių rezultatas specifiniai DNR
fragmentai elektroforezės gelyje
A
A
QTL geno vieta
chromosomoje
Laboratorinių DNR tyrimų rezultatas:
elektroforezės gelis
Lauko bandymas
B
Žymuo, susijęs
su QTL
C
DNR pavydžiai
Genų sąlygojančių požymį
buvimas nustatomas pagal
fenotipinio požymio buvimą (pvz.
ankstyva augimo pradžia)
A
B
C
Su požymiais galimai susijęs žymuo
nustatomas pagal specifinius DNR
fragmentus elektroforezės
gelyje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
QTL samprata
• Dauguma ekonomiškai svarbių požymių yra sąlygojami
daugelio genų (poligenų).
• Šie genai vadinami kiekybiniais, nes kiekvieno geno įtaką
galima išreikšti skaitine verte (kiekybe).
• Kiekybinių genų vietos chromosomose vadinamos lokusais
(kiekybinių požymių lokusai- QTL).
• Tarp jų yra genai turintys didesnę įtaką požymiui
(pagrindiniai genai).
• Galima surasti molekulinius žymenis susėjusius su
pagrindiniais genais ir naudoti kaip pagalbinę priemonė
atrenkant individus (atranka žymenų pagalba (MAS)).
QTL1
20%
Žymuo
QTL2
50%
QTL3
15%
5%
5%
5%
Kiekybinį požymį sąlygojantys stipresnės įtakos genai, kurių vietos chromosomose
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
vadinamos kiekybinio požymio lokusais (ang. trumpinys- QTL).
Darius Danusevičius
QTL paieškos prielaidos
Požymis kontroliuojami eilės genų, kurių įtaka išreikšta procentais
(pavyzdžiui kuo didesnis procentas tuo daugiau medienos)
QTL1
QTL2
Žymuo
N
5%
5%
• Priklausomai nuo QTL, žymenys gali turėti
skirtingą įtaką požymio kintamumui
5%
• QTL požymis sąlygojamas keliolikos genų=
žymens svarba priklausys nuo susijusio geno
įtakos
15%
• Tikslas rasti žymenis susijusias su šiais
genais, galutinis tikslas- rasti pačius genus.
Žymuo
M
50%
• Kai kurie genai turi didesnę įtaką ar įtakuoja
kitų genų veiklą (vadinami kiekybinio
požymio lokusais).
20%
• Jeigu visi požymį įtakuojantys genai turėtų
vienodą įtaką, būtu sunku juos visus atskirai
identifikuoti ir naudoti selekcijoje.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Žymenų ir QTL sąsajos nustatymo
komponentai
1. Polimorfinė populiacija ir požymis (daug skirtingų tikslinio geno formų) ir
bent vienas iš tėvų heterozigotinis.
2. Tinkama žymenų sistema tikslinio požymio QTL paieškai.
3. Kryžminimai (ar bus žymenys atskirti nuo genų per rekombinaciją?).
4. Palikuonys = QTL nustatymo populiacija (požymių (QTL buvimo) ir
žymenų sąsajos įvertimas).
5. Žymens ir QTL sąsajos įvertinimo statistiniai metodai
Kryžminimas
G
Daug alternatyvių geno formų
Polimorfinė populiacija
g
Palikuonys
Statistiniai metodai: požymio
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
ir žymens sąsajai
nustatyti
Žymenų ir QTL sąsajos nustatymo
principas (1)
QTL nustatomi įvertinant sąsajas tarp molekulinių žymenų ir tikslinių
požymių prieš ir po rekombinacijos (tėvai kryžminimai  palikuonys).
Tikrinama ar rekombinacija atskyrė fenotipinį požymį ir molekulinį žymenį
Hipotezė: netiesioginis žymuo M susijęs su
teigiamu genu (G), žymuo m susijęs su
neigiamu genu (g)
Principas: kuo silpniau žymuo susiejąs su
genu, tuo toliau yra jų lokusai chromosomoje,
tuo dažniau juos atskiria rekombinacija
Lytinės
ląstelės
žiedadulkėse
Porinės chromosomos
Žymuo
M
m
Genas
G
g
Rekombinacija: lytinų ląstelių
formavimo metu iš tėvo ir motinos
gautos porinės chromosomos
pasikečia dalimis. Galimi 4 genotipai:
M-G; M-g; m-G; m-g
G
Pakankamo dydžio ir
polimorfizmo tėvinė populiacija
g
Kryžminimas
m
g
m
m
m
g
G
m
g
m
g
m
G
m
G
g
3 rekombinantiniai
5 nerekombinantiniai
genotipai (38 %) (QTL
genotipai (QTL ir
ir žymuo nesusieją
žymuo vienoje
nes buvo atskirti)
sukibimo grupėje)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Įvertinimas, statistiniai
metodai
Darius Danusevičius
Žymenų ir genų sąsajos nustatymo
principas (2)
Tėvai
Hipotezė: netiesioginis žymuo M susijęs su teigiamu genu (G), žymuo m susijęs su
neigiamu genu (g)
Tėvas
Motina
Kryžminimas
Žymuo
M
m
m
m
Genas
G
g
g
g
Palikuonys
Rekombinacija
M m
m
m
m
m
M
g
g
g
G
g
g
G
85 %
15 %
Anksti ir vėlai
sezoninį augimą
pradedantys p. eglės
genotipai Baltijos
regiono eglės
populiacijų bandyme
Atlikti kryžminimai: teigiamą požymį (geną
G) ir jo žymenį M) turintis individas (vėlyva
sezoninio augimo pradžia ir tiesus)
kryžminamas su šio geno neturinčiu
individu (ankstyva augimo pradžia ir
m
kreivas, daugiastiebis).
g Palikuonyse nustatyta, kurie iš jų turėjo
žymenį (M ar m) ir geną G ir g (pagal
požymio išraišką fenotipe).
Rekombinacijos dažnis tik 15%. Žymens M
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
patikimumas- 85 %
Darius Danusevičius
3.3.2 QTL nustatymo populiacijos
sukūrimas ir fenotipiniai požymiai
Populiacijos sukūrimo principas
Pavyzdžiui,
ankstyvą augimą
sąlygojančius
genus bus galima
identifikuoti pagal
pumpurų sprogimo
laiką
1. Tėvų parinkimas: turintys norimus
genus, kurie identifikuojami pagal
fenotipinio požymio išraišką; požymis turi
būti paveldimas)
2. Kryžmindamas= testas ar
rekombinacija nutrauks
žymens ir geno sąsają?
Molekulinių žymenų sistema, galinti
identifikuoti DNR fragmentus susijusius
su tikslinais genais
DNR+
restrikta zė
DNR
frag m en tai
S pec.
m e m brana
S ervetėlės
traukai
G elis
K e m pinė
Š arm inis
skystis
1
3. Palikuonys = QTL nustatymo populiacija:
palikuonių įvertinimas tikslu nustatyti kiek palikuonių
turėjo ir fenotipinį požymį ir molekulinį žymenį =
sąsajos stiprumas (nuo 100-200 medelių)
D N R su karp y m as į
fragm en tu s. Išskiriam a
D N R ir sukarpom a į
įvairaus d yd žio fra gm entu s
restriktazių pa galba.
2
E lektroforezė . V eikiant
elektrai D N R fra gm entai
juda skirtingu greičiu =
D N R fra gm entų atsk yrim as
3
D N R p erkėlim as. V eikia nt
kapiliarinėm s jėgom s
šarm inis sk ystis k yla
aukštyn; D N R fra gm entai
išsivynioja ir pereina iš
gelio į spec. m em braną
M em brana su
D N R fragm entais
N uplauti
neapisijungusius
ž ym enis
F oto p opierius
DNR
m arkeriai
m aišelyje
4
H ib rid izacija . M em brana su D N R
panardinam a sk ystyje su radioaktyviais
D N R m arkeriais, kurie prisijungia tik prie
tam tikrų D N R fra gm entų.
5
P erkėlim as į fotop op ierių . Fotopopierius
uždedam as ant m em brano s su D N R .
R adioaktyvūs žym enis palieka D N R
fra gm entų grupių žym es.
Kiekviename etape medžiaga ir metodai parenkami taip kad maksimaliai palengvintų tikslo
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
įgyvendinimą
Darius Danusevičius
Tėvinės poros
Tėvinių porų parinkimo problema: kaip parinkti heterozigotines
poras (bent vieną iš tėvų)?
Nuo to priklauso QTL nustatymui reikalingos populiacijos
sukūrimo metodai
Heterozigotinis individas turi skirtingas požymį sąlygojančio geno formas,
vadinamas aleliais (polimorfinis genas)
Homozigotinis
Heterozigotinis
Homozigotos atveju sunku
nustatyti ar rekombinaciją
tarp žymens (M) ir geno (G),
nes M ir G vienodi abejose
chromosomose (įvykus
rekombinacijai tarp M ir G
vienoje chromosomoje,
žymuo M ar genas G patektų
iš kitos chromosomos)
Rekombinacija tarp porinių
chromosomų lytinėje ląstelėje
Po
rekombinacijos
Žymuo
M
M
G
G
M
G
M
m
m
G
g
G
Nors žymuo M ir
genas G buvo
skirtingose
M
sukibimo grupėse
(nesusiję), jie bus
G
aptikti kartu
palikuonyse
Žymuo M ir
genas G
M
nesusiję:
išreikštas genas
G neturės
g
žymens
M
LIETUVOS MIŠKŲ
INSTITUTAS
Darius Danusevičius
QTL populiacijos sukūrimas (1)
Klasikinis modelis: tikslas sukurti heterozigotas 2-oje kartoje
(prielaida: M1 susijęs su Q1 (aukštas), o M2 su Q2 (žemas)
1 karta
Parenkami
kontrastingų
požymių tėvai
Bus reikalingi kodominantiniai
žymenys nes reikės atskirti
heterozigotinius palikuonis
M1
M1
M2
M2
Q1
Q1
Q2
Q2
Žema
Aukštas
2 karta
Tarpinis
Parenkami tarpinio
M1
aukščio tėvai, kurie
yra heterozigotiniai Ar aukšti ?Q 1
3 karta
Jei neįvyko
rekombinacija tarp
M1
M1
M ir Q, galimos 3
Q1
Q1
genotipų
kombinacijos
Genotipas 1
Žymuo
Aukščio QTL
Savidulka
M2
Galimas ir atgalinis kryžminimas su vienu
iš tėvų (tik vienas iš tėvų bus
heterozingotinis, todėl bus galima
nustatyti tik vieno iš alelių sąsają su QTL,
todėl dominantiniai žymenys būtų
pakankami
Q2
Ar tarpiniai ?
Ar žemi ?
M1
M2
M2
M2
Q1
Q2
Q2
Q2
Genotipas 2
Bandoma ar genotipai atitinka fenotipus:
pvz. ar palikuonys tik su M1 žymeniu
tikrai aukščiausi.
Genotipas 3
3 karta= “QTL paieškos populiacija”: lyginamos tokios sąsajos M1-Q1, M2-Q2, pvz. ar
yra skirtumai tarp M1M1 ir M1M2 genotipų vidutinio aukščio? PROBLEMA su miško
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
medžiais: savidulka ar giminių kryžminimai = mažai gyvybingi palikuonys
QTL populiacijos sukūrimas (2)
Trijų kartų modelis: tikslas sukurti heterozigotas 2-oje kartoje. Minusas –
reikia 3-jų kartų (nemažos laiko sąnaudos) . Išeitis panaudoti selekcines
populiacijas su jau atliktais kryžminimais.
Motina: žema
Tėvas: aukštas
Tėvas: aukštas
Motina: žema
1 karta
Žymuo
Parenkami
kontrastingų
požymių tėvai
2 karta
Parenkami tarpinio
aukščio tėvai, kurie
yra heterozigotiniai
3 karta
M1
M1
M2
M2
M3
M3
M4
M4
Q1
Q1
Q2
Q2
Q3
Q3
Q4
Q4
Motina: tarpinė
Tėvas: tarpinis
M1
Q1
Ar Aukšti ?
Jei neįvyko
M1
M3
rekombinacija tarp
Q3
M ir Q, galimos 4 Q1
genotipų
Genotipas 1
kombinacijos
Aukščio QTL
M3
M2
Q2
Ar Tarpiniai ?
Q3
Ar Tarpiniai ?
M4
Q4
Ar Žemi ?
M1
M4
M2
M3
M2
Q1
Q4
Q2
Q3
Q2
Genotipas 2
Genotipas 3
Bandoma ar
M4 genotipai
atitinka
Q4 fenotipus
Genotipas 4
3 karta= QTL populiacija: lyginamos tokios sąsajos M1-Q1, M2-Q2, M3-Q3,
LIETUVOS MIŠKŲ
INSTITUTAS
M4-Q4, pvz. ar yra skirtumai tarp M1M3 ir M1M4 genotipų vidutinio
aukščio?
Darius Danusevičius
QTL populiacijos sukūrimas (3)
Dviejų kartų modelis (1): tikslas parinkti genetiškai tolimas tėvines poras,
tikintis, kad bent viena jų bus heterozigotinė (aukštos medžių genetinės
įvairovės panaudojimas; galimi rūšių hibridai).
Problema – galimybė, kad tėvai homozigotiniai; sprendimas – kontroliniai kelių
kandidatinių tėvinių porų palikuonių heterozigotiškumo tyrimai.
Kontroliniai heterozigotiškumo
tyrimai
Tėvas: tarpinis
Motina: tarpinė
1 karta
M3
M4
M1
M2
Parenkami ženkliai skirtingos
Q4 -žemas
kilmės tarpinio aukščio tėvai, aukštas-Q1
aukštas- Q3
Q2 -žemas
tikėtina- heterozigotiniai
Tarpiniai + Žemi=žemesni
Fenotipai: aukšti+ tarpiniai =aukštesni
2 karta
Jei neįvyko rekombinacija,
galimos 4 genotipų
Lyginami M2
M4
M4
M3 M2
M1
M3 M1
kombinacijos, tačiau žymenys
Q4
Q4
Q2
Q3 Q2
Q1
Q3 Q1
identifikuos tik M1 ir M3
genotipus: bus lyginami tik 2Genotipas 3 Genotipas 4
Genotipas 2
jų grupių fenotipai = nukentės Genotipas 1
tikslumas
2 karta= QTL populiacija: tinka dominantiniams žymenims; lyginamos tokios
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
sąsajos pvz. M1 su Q1 (tėvas) ir pvz. M3 su Q3 (motina).
Darius Danusevičius
QTL populiacijos sukūrimas (4)
Dviejų kartų modelis (2 pusiau sibai): tikslas parinkti potencialiai heterozigotinį
motinmedį ir naudoti laisvo apsidulkinimo sėklas. Vienodai tinka dominantiniams
ir kodominantiniams žymenims.
Problema – galimybė, kad tėvai homozigotiniai; sprendimas – kontroliniai kelių
kandidatinių tėvinių porų palikuonių heterozigotiškumo tyrimai.
Kontroliniai heterozigotiškumo tyrimai
1 karta
Parenkami heterozigotiniai
motinmedžiai (tėvas laisvo
apdulkinimo)
Motina: tarpinė
Tėvas: žiedadulkių mišinys
x
x
M3
M4
X
X
Q3
Q4
2 karta
Jei neįvyko rekombinacija, galimos 2 genotipų
kombinacijos; žymenys identifikuos tik M1 ir M3
genotipus: bus lyginami tik 2-jų grupių fenotipai
Aukštesni
Žemesni
x
M3
x
M4
X
Q3
X
Q4
Genotipas 1
Genotipas 2
2 karta= QTL populiacija: lyginamos tokios sąsajos pvz. M3 su Q3 ir pvz. M4
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
su Q4.
Darius Danusevičius
Tiksliniai fenotipiniai požymiai (1)
QTL nustatymo efektyvumas didžia dalimi priklauso nuo
fenotipinio požymio.
Kriterijai:
• Genų sąlygotumo kompleksiškumas (vienos ir kelių grupės
susijusių genų) ir QTL nustatymo lengvumas.
• Ekonominė vertė (QTL nustatymas duotų taikomąją
naudą).
• QTL analizės tikslas – nustatyti kiek genų kontroliuoja
požymį ir koks jų santykinis efektas (įtaka požymiui).
Tinkamiausias požymis: sąlygojamas nedidelio genų
skaičiaus; genų įtaka- nuo vidutinės iki stiprios; stipriai
paveldimas (ribota aplinkos sąlygų įtaka)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Tiksliniai fenotipiniai požymiai (2)
Tikslinės miško medžių fenotipinių požymių grupės:
• Adaptaciniai požymiai (pvz. fenologija: ramybės būsena,
sezoninio augimo pradžia ir pabaiga, ūglių medėjimas).
• Reprodukciniai požymiai (pvz. lytinė brada ir asimetrija,
žydėjimo gausumas, vegetatyvinis dauginimas).
• Medienos kokybė (pvz. bazinis tankis, cheminės savybės,
mikrofibrilių kampas).
• Atsparumas kenkėjams (galima panaudoti gausią ž.ū. kultūrų
patirtį).
Tokie požymiai kaip medžių aukštis ar produktyvumas yra
kompleksiniai (keliolikos požymių grupių sąveikos išraiška),
todėl efektyviau pradžioje nustatyti šių pirminių požymių
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
QTL.
Darius Danusevičius
Miško medžių QTL medžiaga (1)
Tam, kad gauti heterozigotinius individus QTL tyrimams galima naudoti:
1) Skritingų populiacijų palikuonis. Du tolimos kilmės ir skirtingų adaptacinių
požymių genotipų adaptacinių požymių lokusai bus polimorfiniai (skirtingi
tam tikro geno aleliai), o dauguma jų palikuonių – heterozigotiniai.
2) Rūšių hibridai. Du artimų rūšių individai yra genetiškai skirtingi daugumoje
lokusų, todėl jų palikuonys bus heterozigotiniai. Tikslinga naudoti stipriai
tam tikroje rūšyje išreikštų požymių QTL identifikacijai (pvz. “pendula”
genas Picea abies porūšyje ar Pinus contorta atsparumas šalčiui).
P. sylvestris populiacijų bandymas Lietuvoje. Stulpeliai parodo
populiacijų kilmės vietas
LIETUVOS
MIŠKŲ INSTITUTAS
Egzotinių pušų bandymasP. sylvestris
dešinėje,
Darius Danusevičius
Pinus contorta kairėje
Miško medžių QTL medžiaga (2)
Populiacijų bandymai. Tai želdiniai skirti populiacijų genetinės įvairovės,
požymių genetinio kintamumo, paveldėjimo laipsnio ir perkėlimo naudos
tyrimui. Populiacijų atstovai tolygiai išdėstyti bandymo plote (sumišrinti), kad
specifinių dirvos sąlygų įtaka jų augimui būtų kuo mažesnė.
Bandymo
įveisimas:
medeliai
išdėstomi
eilėse pagal
spec.
mišrinimo
schemą
4 raudoni tam tikros
grupės individai auga
beveik visose dirvos
sąlygose, todėl jų
grupės vidutinės
požymiu reikšmės
nebus stipriai
iškraipytas dirvos
sąlygų skirtumų.
Pinus sylvestris
tolimų populiacijų
bandymas (kilmės
vietos pažymėtu
stulpeliais, kurie
parodo šių
populiacijų
produktyvumąaukščiau brūkšnio
pranašesni už
vietines.
P. eglės populiacijų bandymas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Miško medžių QTL medžiaga (3)
Eglės populiacijų perkėlimo bandymas Lietuvoje. Populiacijų kilmės vietos
pažymėtos taškais. Rezultatai: genotipai ženkliai skyrėsi savo adaptaciniais
požymiais, priklausomai nuo kilmės vietos temperatūros ir fotoperiodo.
Adaptacinių požymių
QTL paieškoje,
kryžminti šiaurinį ir
pietinį genotipus.
Palikuonyse dominuotų
heterozigotiniai lokusai
A
B
a
b
A
B
a
b
QTL paieškos
tyrimai
Š
P
Š-šiaurinis, Ppietinis genotipai
Taškai žymi kilmės vietas. Didesni taškai= ankstesnė sezoninio
augimo pradžia ir pabaiga, mažesnis aukštis, daugiau dvistiebių
medelių. Šiaurinių ir pietinių genotipų adaptaciniai požymiai
esminiai skiriasi.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
3.3.3 QTL paieškos molekulinių žymenų
sistemos
Žymenų sistemos tikslas QTL tyrimuose yra identifikuoti tikslinių
požymių genus jų paveldėjimo iš tėvų į palikuonis metu.
Žymenų sistemos skiriasi genų žymėjimo efektyvumu ir kaštais,
kas turi esminę įtaką QTL nustatymo metodikai.
Specifinis DNR fragmentas
elektroforezės gelyje būdingas tik
tam tikrą požymį turintiems
medžiams
G
Polimorfinė populiacija
(Žymuo susijęs su požymiu)
g
Kryžminimas
(rekombinacija)
Palikuonys
Žymuo susijęs
su požymiu
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Žymenų tipai (1)
• Netiesioginiai žymenys tai žymenys, kurie randasi netoli nuo
geno užimamos DNR atkarpos toje pačioje chromosomoje ir
yra paveldimi vienoje sukibimo grupėje (dauguma žymenų yra
netiesioginiai).
• Tiesioginiai žymenys tai žymenys kurie randasi geno nukleotidų
sekų atkarpoje (nėra problemos su identifikacija).
Tiesioginiai žymenys
Žymuo, tinkantis
aleliui
A
Alelio vieta
tėvinėje
chromosomoje
M
G m
g
Porinių chromosomų rinkinys
Žymuo, susijęs
su A aleliu
Žymuo, tinkantis
aleliui
B
Alelio vieta
motininėje
chromosomoje
Sutartinis žymėjimas: geno
aleliai- G ar g; molekulinis
žymuo M ar m
Netiesioginiai žymenys
21 chromosomų
pora
Alelis- alternatyvi
to paties geno
forma
Žymuo, susijęs
su B aleliu
Alelio vieta
motininėje
chromosomoje
Alelio vieta
tėvinėje
chromosomoje
Sutartinis žymėjimas
M
m
G
g
Sutartinis žymėjimas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Žymenų tipai (2)
Dominantiniai žymenys negali atskirti
vieno geno alternatyvių formų
(alelių). Gali tik identifikuoti ar genas
(vienas iš alelių) yra, pvz. RAPD
Kodominantiniai žymenys- gali
identifikuoti alternatyvias vieno
geno formas (alelius)
Žymuo N gali identifikuoti abu ankstyvos Q1
ir vėlyvos augimo pradžios alelį Q2. Todėl
gali atskirti heterozigotinius genotipus=
tikslesni, bet sudėtingesni.
Žymuo M gali identifikuoti ankstyvos augimo
pradžios alelį Q1 (bet ne jo alternatyvią
formą- vėlyvos augimo pradžios alelį Q2)
1
3
Q1Q2=
Q2Q2=
Q1Q1=
homozigotinis heterozigotinis homozigotinis
tarpinis
vėlyvas
ankstyvas
Q1
TTAG GTGAGTGG
2
GTATATGAGTGG
1
Q2
Q1Q1=
homozigotinis
ankstyvas
N
M
žymuo
RAPD analizės rezultatai: DNR
fragmentai gelyje
2
3
Q1Q2=
Q2Q2=
heterozigotinis homozigotinis
tarpinis
vėlyvas
Q1 ir Q2 aleliai
Žymuo
porinėse
chromosomose gali
RFLP analizės rezultatai: DNR
skirtis tik keliais
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
fragmentai
gelyje
nukleotidais
Darius Danusevičius
Žymenų tipai (3)
Dominantiniai žymenys tinka
vieno motinmedžio genų
identifikacijai jo palikuonių
(pusiau sibų) šeimoje.
Tėvas: aukštas
Motina: tarpinė
M1
M1
M2
M1
Q1
Q1
Q2
Q1
Palikuonis: tarpinis
Kodominantinių žymenų reikia
abiejų tėvų genų identifikacijai
jų palikuonių (pilnų sibų)
šeimoje
Tėvas: aukštas
Motina: žema
M1
M1
M2
M2
Q1
Q1
Q2
Q2
Palikuonis: tarpinis
M1
M2
M1
M2
Q1
Q2
Q1
Q2
Ar M2 susijęs su Q2? Tereikia identifikuoti
Q2 QTL. Tik motinmedis turi M2 ir Q2.
Ar M1 susijęs su Q1 ir ar M2 susijęs su
Q2? Žymenų sistema turi sugebėti
atskirti Q1 ir Q2
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Mikrosatelitai ir QTL
SSR gali būti naudojami QTL paieškoje: SSR yra
kodominantiniai ir gali efektyviai identifikuoti didelį skaičių
tam tikro geno alternatyvių formų (alelių) populiacijoje
pagal kartotinių sekų pakartojimų skaičiaus polimorfizmą
(daug įvairaus ilgio kartotinių sekų fragmentų = daug
alelinių variantų).
Esant aukštam alelių identifikacijos tikslumui ir tikslinių genų
formų įvairovei (polimorfizmui) populiacijoje, yra santykinai
didesnė galimybe rasti sąsajas tarp šių fragmentų ilgio ir
palikuonių tikslinių požymių QTL.
CACACACACACACA
GTGTGTGTGTGTGT
CACACACACACACACACACACACACA
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT
CACACACA
GTGTGTGT
QTL
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
QTL paieškos efektyvumas
QTL paieškos efektyvumas didžia dalimi priklauso nuo
bandomos medžiagos ir taikomos žymenų sistemos
Medžiaga: genetinė įvairovė (skirtingi genai) =
dauguma požymį sąlygojančių alternatyvių genų formų
(alelių) yra skirtingi (polimorfiniai) ir stipriai paveldimi.
Heterozigotinis genotipas (dauguma
genų turi polimorfinius alelius)
DNR
Tėvinė
Motininė
Polimorfiniai aleliai (dvi
skirtingos vieno geno
formos)
Žymenų sistema: turėtų remtis žiniomis apie tikslinių
genų sekas (DNR tyrimai reikalauja nemažų kaštų)
Porinės chromosomos
Pagrindinio ar su juo susijusių genų
dalies sekų žinojimas ženkliai
padidintų žymenų paieškos
efektyvumą
Monomorfiniai aleliai
(dvi vienodos vieno
geno formos)
Atsitiktinės žymenų sistemos
bando atsitiktiniu būdu aptikti
gana mažą DNR sekų fragmentą
tarp milijono kitų sekų
5 genai sąlygojantys vieną požymį
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
(didesni turi
svaresnę
Darius
Danusevičius įtaką)
Miško medžių QTL: žymenys
• Naudojant atsitiktines žymenų sistemas, tikimybė aptikti QTL žymenis
nedidelė (neefektyvu),
• Išeitis- paruošti žymenis pagal tam tikrose sąlygose išreikštų polimorfinių
genų dalių kopijas (EST žymenys).
• Principas: vieno genotipo kopijos auginamos skirtinguose, tam tikro geno
išraišką skatinančiose sąlygose; izoliuojama iRNR→cDNR-AFLP skirtingų
cDNR identifikacijai, žymenų kūrimas iš polimorfinių cDNR dalių)
klonai
klonai
sausra laistymas
Išreikšti genai
šaltis
šiluma
Išreikšti genai
klonai
pakenktas sveikas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Išreikšti
genai
Darius
Danusevičius
Neutralūs ir išreikšti žymenys
Kadangi didžioji dalis genomo sudaryta iš nekoduojamos
DNR(~95%), dauguma tradicinių žymenų sistemų žymi
nekoduojamas sekas, kurios nepriklausomos nuo atrankos
(žymenys neutralūs atrankai)
Žymenų sistemos pasirinkimas priklauso
nuo tyrimo tikslo:
Neutralūs žymenys tinkamiausi siekiant
įvertinti genetinę įvairovę ar atrankai
neutralių požymių QTL.
Ieškant adaptacinių požymių QTL,
išreikštus genus identifikuojantys
žymenys yra pranašesni (atsitiktinė
paieška neefektyvi).
Išreikšti žymenys: EST, cDNR-AFLP;
neutralūs pvz.: RFLP, RAPD, AFLP
Sekvenuoto Populus genomo dydis- 500 mln. bp,
Eucalyptus 340-580 mln bp, Pinus 25 000 mln. bp
Genominė DNR (visų chromosomų DNR laisvoje formoje): dalys kur yra
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
aktyvūs genai sudaro tik ~15 proc (storos atkarpos
paveiksle).
Darius
Danusevičius
Specialių žymenų kūrimas (1)
•Genų ekspresijos bandymas: vieno genotipo kopijos
skirtingose sąlygose.
•iRNR izoliacija ir kopijavimas į cDNR (klonavimas plazmidėse),
•AFLP analizė: polimorfinių cDNR identifikacija,
•Polimorfinių cDNR bangų izoliavimas gelyje ir sekvenavimas,
(a) Žymenų pažyminčių tikslinius ar susijusius genus
kūrimas,
(b) cDNR atitikmenų paieška DNR mikrosekų metodu, genų
bibliotekose siekiant nusakyti kandidatinius genus.
•Žymenų testavimas ir naudojimas QTL paieškoje (pagrinde
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
SNP ir EST žymenys).
Darius Danusevičius
Specialių žymenų kūrimas (2)
“cDNR+AFLP=EST” metodas: tikslas identifikuoti tam tikrose aplinkose
išreikštus genus ir iš jų pagaminti žymenis, taikomus įvairiose žymenų
sistemose.
1. Tam tikroje aplinkoje auginamų genotipų iRNR izoliavimas iš
audinių, kuriuose tiksliniai genai yra išreikšti (pvz. pumpuras, jei
tiriami pumpurų ramybės būsenos genai).
2. Komplimentarios DNR (cDNR) sintetinimas pagal iRNR kopijas
ir cDNR sukarpymas dviejų skirtingų restriktazių pagalba (viena
dažnai, kita retai kerpanti).
3. DNR fragmentų galų jungimosi neutralizavimas prijungiant
adapterius (pagal restriktazių sekas)
4a. PCR 1 ciklas: naudojami 2 pradmenys (sekos= restriktazių
atpažįstamos sekos + 1 nukleotidas). Atrenkami pradų sekoms
tinkantys fragmentai.
4b. PCR 2 ciklas: 2 nauji pradmenys (sekos = restriktazės sekos
+ 1 +2 ar > naujų nukleotidų). Rezultate atrenkami tam tikri
fragmentai
5. Elektroforezės gelyje bus matomi po 2-jų atrankos ciklų patekę DNR fragmentai.
Polimorfiniai fragmentai- tai bandomose sąlygose išreikšto geno dalys (genotipai
identiški, skirtumas tik aplinkos sąlygose, kurios įtakavo skirtingų genų išraišką). Šie
fragmentai izoliuojami iš gelio ir sekvenuojami tolesniam išbandymui.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Specialių žymenų kūrimas (3)
6. cDNR izoliavimas ir klonavimas
Restriktazės
cDNR
7. cDNR sekvenavimas
Rekombinuotos
plazmidės
cDNR
Bakterijos
cDNR fragmentų
identifikacija: nukleotidų
sekų nustatymas
automatiniuose
sekvenatoriuose
Gelis
cDNR
Elektroforezės gelyje izoliuoti polimorfiniai cDNR fragmentai
(išreikštų genų dalys) įterpiami į bakterijų plazmides (patogiau
atlikti tolesnius sekvenavimo darbus)
9. Testavimas bandymuose.
Žymenų kūrimas
ir testavimas
8. Atitikmenų paieška.
DNR mikrosekų
bibliotekose
Sekų lyginimas
duomenų bazėse
www.ncbi.nlm.nih.gov
pagrinde EST,
SNP, STS žymenys
(RFLP markeriai ir
PCR pradai),
10. Rezultatas- kandidatiniai genai
Prieš bandant cDNR fragmentus kaip žymenis, bandoma
nustatyti jų sekų atitikmenis su jau rastais genais ar
žymenismi duomenų bazėse ar DNR mikrosekų
MIŠKŲ INSTITUTAS
bibliotekose (hibridizacija su LIETUVOS
žinomais genais)
Darius Danusevičius
Specialių žymenų kūrimas (4)
AFLP detalės: adapterių prijungimo, PCR pradmenų gamybos ir DNR
pagausino principai
1. DNR sukarpymas 2 skirtingomis
restriktazėmis,
Bandoma DNR
2. Adapterių prijungimas (“lipnių”
fragmentų galų neutralizavimas),
3a. Pirmas PCR ciklas: pradmuo=
restriktazės atpažįstama seka + 1 naujas
nukleotidas; PCR pagausinimas tik tam
tikrų fragmentų, turinčių naują nukleotidą
po restriktazės sekos.
3b. Antras PCR ciklas: specialių pradmenų
gamyba- restriktazės seka + 1 + 2
nukleotidai; PCR amplifikacija (tam tikrų
fragmentų atranka)
Restriktazė
Adapteris
Adapteris
Pradmuo
Pradmuo
Pradmuo
Pradmuo
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Specialių žymenų kūrimas (5)
Bandymas klimatinėje kameroje. Tikslas: rasti žymenis susijusius su augimo
pabaigos QTL. Metodai: Du to paties genotipo klonai auginami skirtingose
sąlygose ir išreikštų genų identifikacija pagal cDNR-AFLP analizę.
Augimo sąlygų imitacija
Šviesa,
+20C
Augimo pabaigos imitacija
Tamsa,
+10 C
Pumpurų krovimo pradžios
stadijoje iš pumpurų
izoliuojama iRNR
cDNR sintetinamas ir
sukarpymas restriktazėmis
Adapterių prijungimas
PCR 1 ciklas (pradmenys+1
nukleotidas)
PCR 2 ciklas (pradmenys+2
ir > nukleotidai)
Elektroforezė, polimorfinių
bangų izoliavimas ir žymenų
kūrimas
Rezultatas: gauti skirtingi iš viršūninių meristemų izoliuotos iRNR fragmentai –
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
galimos atsakingų genų (QTL) dalys; reikalingas tolesnis patikrinimas tyrimais Darius Danusevičius
Specialių žymenų kūrimas (5)
Bandymo klimatinėje kameroje pavyzdys. Tikslas įvertinti p. eglės genotipų
toleranciją šalčio sausrai: vienas genotipų rinkinys laikytas 1-2 savaites su
užšaldytomis šaknimis po intensyvia šviesa (pažeidimo pobūdis: intensyvi
šviesa= garinamas vanduo, o užsalusios šaknys nekompensuoja vandens
netekties = džiuvimas), kitas tų pačių genotipų rinkinys – optimaliose
augimui sąlygose. Nuotraukoje vonios pripildytos gliukolio (-3C) intensyvioje
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
šviesoje.
cDNR pritaikymas žymenų sistemose
•EST žymenų gamyba: EST tai 200-500 bp ilgio polimorfinių cDNR
fragmentų dalys, žyminčios cDNR pradžią ir pabaigą (PCR pradai ar
markeriai hibridizacijai DNR gardelėse ir RFLP sistemoje)
•EST savo ruožtu naudojami SNP (pavienių nukleotidų polimorfizmo
atkarpų) žymenų paieškai
•DNR mikrosekose - geną identifikuojančios dalys.
•RFLP markeriai hibridizacijai: ilgis~100 bp (polimorfiniai cDNR
fragmentai) -1500 bp (identifikuoti nedideli genai)
•Pradai žymintys unikalių sekų atkarpas (STS) (SSR ar ISSR pradai:
specifinės DNR atkarpos, juosiančios 2-3 bp (1-10 bp) dydžio sekų
pasikartojimo regionus DNR molekulėje)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Genominės duomenų bazės
Puiki išeitis žymenų sistemų analizės optimizavimui (markerių ,
adapterių pradų sekų paieška).
Nacionalinio biotechnologijų centro duomenų
bazės: cDNR ar EST sekos
Augalų genomo duomenų bazė: RFLP markeriai
tam tikro geno hibridizacijai (kukurūzas)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
EST sukūrimas
Genotipo atsakas į
stresą= išreikšti genai
•Genotipai bandomi tam tikroje aplinkoje.
•Iš specifinių audinių, kuriuose vyksta
atsakas į stresą, izoliuojama iRNR (geno
kopijos), iš jų sintetinamos stabilesnės
cDNR molekulės.
•Atsitiktiniu būdu atrankos cDNR dalinai
sekvenuojamos ir lyginamos su cDNR
bibliotekose esančiomis žinomos funkcijos
cDNR sekomis
iRNR
cDNR
ACGGACUG
Sekvenavimas ir
atitinkančių sekų
paieška bibliotekose
•Nustačius atitinkamus, pagaminami EST
žymenys identifikuojantį tam tikrą geną.
•EST žymenys naudojami QTL testavimui
ir kandidatinių genų paieškos tymuose.
Nacionalinio biotechnologijų
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
centro cDNR
duomenų bazės
Darius Danusevičius
Žymenų sistemos: santrauka
• RFLP (+) tiksli , kodominantinė, (-) reikalauja daug darbo,
nemažo DNR kiekio, ir darbo su radioaktyviomis medžiagomis.
• RAPD (+) nedaug DNR (tinka sėklų analizėms), pigus, greitas
(-) dominantinis ir mažiau tikslus; patobulinimas- AFLP (RFLP
ir PCR kombinacija: tikslesnis, vis tiek dominantinis),
• Eilė PCR ir restriktazių panaudojimu pagrįstų naujų sistemų,
kurios skiriasi tuo kaip gaunami PCR pradai ar markeriai
identifikacijai (kodominantiniai, tikslūs):
• EST, SCAR, STS, SNP (pradų sekos iš cDNR bibliotekų ar genų
ekspresijos tyrimų, iš genominės DNR bibliotekų ir
polimorfinių RAPD fragmentų)
• Efektyvus miško medžių žymenų generavimo būdas- genų
sekų duomenų bazių analizė ar genų ekspresijos tyrimai ir
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
DNR mikrogardelių panaudojimas
Darius Danusevičius
3.3.4. QTL nustatymo statistiniai metodai
•Statistinių metodų tikslas nustatyti potencialaus QTL žymens ir požymio ryšio
esmingumą ir QTL žymens įtaką fenotipinio požymio išraiškai.
•Paversti DNR fragmentų buvimą gelyje į skaičius (0- nėra, 1- yra) ir suskirstyti
palikuonių fenotipinių požymių vertes pagal kiekvieno fragmento buvimo ir nebuvimo
klases (pagal žymenų genotipus).
•Kiekvienam fragmentui (potencialiam žymeniui), palyginti palikuonių fenotipinio
požymio vidurkius tarp tarp žymenų genotipų (t.y. nustatyti pvz. palikuonių aukščio
skirtumus tarp M1M1 ir M2M2 (kodominantinis žymuo) ar tarp turinčiu ir neturinčių M
fragmento palikuonių (dominantinis žymuo):
•ANOVA, t-testas, regresija (kodais išreikštų žymenų genotipų sąsaja su požymio
fenotipu),
•Chi-kvadrato testas (kategoriniai kintamieji).
• Jei skirtumai esminiai- žymuo susijęs su atitinkamo požymio QTL; skirtumo tarp
vidurkių esmingumas = žymens sąsajos su QTL stiprumo rodiklis.
•Jei yra daugiau nei vienas potencialus žymuo (žymenų polimorfizmas gelyje),
naudojamas intervalų interpoliacijos (maksimalios tikimybės) metodas (Maximum
Likelihood-Lander & Botstein, 1989), alternatyva Composite Interval Mapping (Linked
markers-Zeng, 1993).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Duomenų paruošimas
100
400
1200
2000
Fragmentų
dydžio skalė
100
1
1
1
1
1
1
400
1
1
1
1
1
1
1200 0
0
0
0
1
1
2000 1
1
1
1
1
1
A A B B C C
A A B B C C
Genotipų , turinčių tam tikro ilgio DNR
fragmentą skaičius (%) kiekvienoje
žievės formos klasėje
DNR fragmento dydis (bp)
DNR fragmento dydis (bp)
DNR fragmento dydis (bp)
DNR fragmentų (bangų) buvimas gelyje paverčiamas į 0 ir 1
duomenų masyvą pagal fragmentų dydį ir požymio išraiškos
vienetą.
Ž ie v ė s fo rm a
100
400
1200
2000
A
100
100
0
100
B
100
100
0
100
C
100
100
100
100
Palikuonys
Palikuonys
Eglės žievės forma
A
B
C
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Žymens ir požymio ryšys (1)
Tikslas rasti žymenis, susijusius su
sezoninio augimo pradžios QTL
1
2
3
Tėvinė populiacija: polimorfizmas augimo
pradžios laike, pvz., provenencijų bandymas
QTL genotipų požymiai: Q1Q1=
homozigotinis, ankstyva pradžia; Q1Q2 =
heterozigotinis, tarpinis; Q2Q2 =
homozigotinis, vėlyvas.
Kryžminimui parenkami tėvai: ankstyvas
(Q1Q1), tarpinis (Q1Q2), atliekami jų
DNR tyrimai (pvz. RFLP), kur žymuo M1~
susijęs su Q1 (ankstyvas), o M2 ~ susijęs
su Q2 (vėlyvas).
Jei M žymuo susijęs su augimo pradžios QTL, tai po
rekombinacijos palikuonys tik su M1 žymeniu bus
ankstyvi, o su M1M2 – tarpiniai.
Q1Q1=
homozigotinis
ankstyvas
Q1Q2=
heterozigoti
nis tarpinis
Q2Q2=
homozigotinis
vėlyvas
RFLP gelis
Polimorfinio
žymens lokusas
M
M
Tėvas
Motina
Kiti
lokusai
M1
M1
M1
M2 Žymuo
Q1
Q1
Q1
Q2 QTL
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Žymens ir požymio ryšys (2)
1.Atliekami palikuonių DNR tyrimai: RFLP metodu nustatomas palikuonių
RFLP genotipas (M1M1 ar M1M2);
M1M1
Tarpinis M1M1
Fenotipas
lauko
bandyme
M1M2
RFLP
genotipas
M1M1
M1M2
2000
Skirtumas esminis,
p<0,05, R2=78%
Vėlai 2
Augimo
pradžia
1200
Vėlai 2
Augimo
pradžia
(…)
Ankstyvas
Tarpinis
Tarpinis
Ankstyvas
fragmento dydis (bp)
2.Lauko bandyme nustatomas palikuonių RFLP genotipų augimo pradžios
laikas (fenotipas =QTL indikatorius)
Yij= µ +Mi +ij
3. ANOVA pagalba lyginamas RFLP genotipų
Palikuonio Nr.
Žymuo
1 2 3 4
150 vidutinis augimo pradžios laikas: jei skirtumas
M
100
esminis- M žymuo susijęs su augimo pradžios
QTL; skirtumo esmingumas = sąsajos stiprumas
400
Anksti 1
Anksti 1
M1M1 M1M2
Žymens M RFLP genotipai
Skirtumas neesminis
R2=8%
M1M1 M1M2
Žymens M RFLP genotipai
Alternatyva 2: M žymuo
Alternatyva 1: M žymuo
nesusijęs su augimo pradžios
susijęs su augimo pradžios
MIŠKŲ INSTITUTAS
rekombinacijos)
QTL, sąsajos stiprumas R2=78% QTL (atskirtiLIETUVOS
Darius Danusevičius
Žymens ir požymio ryšys (3)
Vertinant kelis žymenų lokusus (polimorfiniai DNR fragmentai
gelyje): ANOVA žymenų sąsajai, Maksimalios tikimybės
algoritmas- atrankai tarp žymenų
2. ANOVA
1. RFLP gelis
1 2 3 4
150
M
100
N
A u g im o
p ra d žia
Žymuo
Palikuonio Nr.
modelis Yij= µ +Mi +ij
Skirtumas esminis
Esminis
2
V ė la i 2
R2=78%
R2=41%
400
A n k sti 1
P
R
Esminis
R2=11%
2
1
1
N1N1 N2N2
P1P1 P2P2
R1R1 R2R2
M1M1 M2M2
Žymens M genotipai Žymens N genotipai Žymens P genotipai Žymens R genotipai
(…)
1200
1
2
Esminis
R2=25%
3. Tinkamiausio žymens nustatymas pagal skirtumo dydį
2000
RFLP
genotipai
M1M1 M1M2 M1M2
M1M1
N1N1 N2N2 N1N1
N1N1
nėra
P1P2
P1P1
P1P1
R2R2 R1R2
nėra
R2R2
Rezultatai: sankabos grupių
žemėlapyje, kur atstumai tarp
žymenų (a) = rekombinacijų tarp
žymenų %
Maksimali QTL
tikimybė tarp
žymenų M ir N
Skirtumo
esmingumas
pvz. F reikšmė
a1
P (25%)
Riba kai
sąsajos
nėra
a2
M (78%) N (41%)
a3
R (11%)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Žymens ir požymio ryšys (4)
Kategoriniams kintamiesiems tinka Chi-kvadrato testas, t.y. kai fenotipinis
požymis vertinamas keliomis klasėmis (pvz. žievės forma): tikrinama ar sąsaja
tarp kiekvieno DNR fragmento ir žievės formos yra atsitiktinė.
Neatsitiktinę sąsają parodo genotipų, turinčių tam tikrą DNR fragmentą,
skaičiaus skirtumas tarp atskirų požymio klasių.
Fragmento dydis 1200 bp
100
80
60
40
20
0
`
A
Eglės žievės forma
A
B
C
Genotipų skaičius (%)
Chi-kvadrato testas naudojamas
nustatyti: ar yra esminis
nukrypimas nuo atsitiktinio DNR
fragmentų pasiskirstymo
atskirose žievės formos klasėse?
Genotipų skaičius (%)
Fragmento dydis 400 bp
B
Žievės forma
C
Skirtumai neesminiai (visų žievės
formų genotipai turėjo vienodą
skaičių genotipų su fragmentu)=
sąsajos tarp fragmento ir žievės
formos nėra
100
80
60
`
40
20
0
A
B
Žievės forma
C
Skirtumai esminiai (tik C
žievės formos genotipai
turėjo šį fragmentą)
Skirtumo esmingumas = QTL ir žymens
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
sąsajos stiprumas
Darius Danusevičius
Žymens ir požymio ryšys (5)
Dominantinio žymens atveju, atliekama ANOVA, kur įvertimas
fenotipinio požymio skirtumo esmingumas tarp palikuonių su
žymeniu ir be žymens.
A
M1
400
M2
1200
M1 ir M2 tarpinė
žievė (B forma
nuotraukoje)
2000
M2 supleišėjusi
žievė (C forma
nuotraukoje)
A B C
B
C
26 medžiai 54 medžių 23 medžiai
Skirtumai tarp žievės klasės vidurkių nustatomi
ANOVA ar t-testu
3
0
0
1
Žymuo M1
Žieves forma balais,
A=1, B = 2, C = 3
M1 lygi žievė (A
forma
nuotraukoje)
100
Žieves forma balais,
A=1, B = 2, C = 3
DNR fragmento dydis (bp)
Dviejų žymenų identifikacijos atvejis (M1 = lygi, M2 = supleišėjusi žievė).
Genotipas M1-M1 = fenotipas (lygi žievė) (A tipas nuotraukoje), M1-M2 =
tarpinė (B) ir M2-M2= supleišėjusi (C).
3
0
0
1
Žymuo M2
Jei skirtumai esminiai = potencialus QTL žymuo
Skirtumų esmingumas = sąsajos su QTL stiprumas
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Žymens ir požymio ryšys (6)
•Tam, kad gauti pakankamą individų skaičių sąsajos analizei reikalingas
pakankamas šeimos palikuonių skaičiaus.
•Pavyzdžiui, dispersinės analizės patikimumas, lyginant 2 medžių grupių
skirtumo esmingumą, priklauso nuo medžių skaičiaus grupėse; paprastai,
lyginant miško medžių kiekybinius požymius, grupių skaičius turėtų būti
nemažesnis nei 20 (priklauso nuo požymio dispersijos).
•Todėl lyginant vieno žymens genotipus, reikėtų apie 40 palikuonių
(20+20)
•Tikėtina, kad dauguma QTL
paieškos žymenų sistemų
produktuos 3-4 polimorfinius
(potencialius) QTL žymenis,
todėl apytikris minimalus QTL
nustatymo populiacijos dydis
> 100 individų
Medžių skaičius kiekvienoje žymens
genotipo grupėje
2
1
20 20
2
1
20 20
2
Viso
20 20 = 120
palikuonių
1
N1N1 N2N2
P1P1 P2P2
R1R1 R2R2
LIETUVOS
MIŠKŲ INSTITUTAS
Žymens N genotipai Žymens P genotipai Žymens R genotipai
Darius Danusevičius
Žymens įtakos nustatymas
Su žymeniu susijusio QTL įtaka požymiui nustatoma lyginant
žymens genotipų fenotipinio požymio skirtumą su kitų žymenų
genotipų skirtumais
Pvz. M žymens genotipų (M1M1 ir M2M2) skirtumas pakeltas
kvadratu / iš kitų žymenų genotipų skirtumų kvadratinės sumos.
M įtaka= Gm2 / suma(Gi2)
Maksimali QTL tikimybė
tarp žymenų M ir N
1 2 3 4 5 6 7 8
Augimo pradžios
skirtumas, dienomis
=7*7 / ((4*4)+(6*6)+(3*3)) = (49 /61)*100 = 80 %
a1
P
a2
M (80%)
Riba kai
sąsajos
nėra
a3
N
R
Žymenų išdėstymas sankabos grupėje (cM)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Intervalinė interpoliacija
Jei yra keli QTL žymenys, tinkamiausias nustatomas Maksimalios
tikimybės1 metodu kiekvienam žymeniui paskaičiuojant LOD*
rodiklį, kuris pagrinde išreiškia rekombinacijos tarp žymens ir
QTL dažnį, dažnius paverčiant tikimybėmis.
LOD= log (Ty sąsaja yra/ Tn kad sąsaja atsitiktinė), kur
Tikimybė (Ty) =Prop(nerekomb)n * Prop(rekomb)m, kur n ir m = nerekombinantų ir
rekombinantų skaičius, Prop = proporcija.
Tikimybė (Tn) =0.5
1-Lander
Maksimali QTL tikimybė netoli nuo M
žymens: LOD interpoliacijos rezultatas
LOD reikšmės
LOD rodiklis
leidžia palyginti
skirtingus
žymenis ir
požymius
n+m
& Botstein, 1989
* LOD- logarythm of odds ratio
Riba kai sąsajos nėra
LOD<3
a2
a1
P
M
a3
N
R
Žymenų išdėstymas sankabos grupėje (cM)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
QTL nustatymo efektyvumo
padidinimas (1)
Palikuonių klonavimas:
a) Fenotipinių požymių įvertinimo
tikslumo padidinimas (vietoje
vieno fenotipo išbandome
keliolika jo kopijų= tiksliau
nustatomas fenotipinio požymio
genetinis sąlygotumas)
b) DNR tyrimams reikalingų
individų skaičiaus sumažinimas
= mažesni kaštai.
Tėvai
Palikuonys
klonuojami
Palikuonys
Išbandomi
Tipinių fenotipų atranka
lauko bandymuose DNR
žymenų identifikacijai
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
QTL nustatymo efektyvumo
padidinimas (2)
Atrankinis genotipavimas- tik atrinktų
palikuonių genotipų DNR analizė (ang.
selective genotyping).
a) Pasirenkami palikuonys su
ekstremaliomis fenotipinio
požymio reikšmėmis, siekiant
padidinti QTL aptikimo
tikimybę.
b) DNR tyrimams reikalingų
individų skaičiaus sumažinimas
= mažesni kaštai.
Tėvai
Palikuonys
Išbandomi
Ekstremalių fenotipų (pvz. aukštas ir
žemas medis) atranka lauko
bandymuose DNR žymenų identifikacijai
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
QTL nustatymo efektyvumo
padidinimas (3)
Grupinis genotipavimas- atrinktų
genotipų mišinio DNR analizė (ang. bulk
segregant analysis).
a) Siekiant padidinti QTL aptikimo
tikimybę, pasirenkami
palikuonys su ekstremaliomis
fenotipinio požymio reikšmėmis
b) Jų DNR apjungiama ir
analizuojama atskirai.
Palikuonys
Išbandomi
DNR
apjungiama
c) DNR tyrimams reikalingų
individų skaičiaus sumažinimas
= mažesni kaštai.
Tėvai
DNR
apjungiama
Aukštų medžių DNR
Žemų medžių DNR
Ekstremalūs fenotipai atrenkami lauko
bandymuose, jų DNR pavydžiai apjungiami ir
LIETUVOS
MIŠKŲ
INSTITUTAS
naudojami žymenų ir požymio
sąsajų
tyrime
Darius Danusevičius
QTL nustatymo statistiniai metodai
(sankibos grupių žemėlapiai)
cM
• Kiekybinis požymis gali būti sąlygojamas keliolikos genų,
• Sudaromi genus žyminčių žymenų sąsajos su jų QTL žemėlapiai
(sankibos grupių žemėlapiai kiekvienai žymenų kategorijai)
• Tam tikrų QTL žymenys išdėstomi žemėlapiuose, kur atstumas
tarp dviejų žymenų išreiškiamas pagal tai kaip dažnai jie
paveldimi vienoje sukibimo grupėje
M1 Tiesus
0
M2 žievė
lygi
11
M3 Vėlyva
forma
25
• Rekombinacijos tarp dviejų žymenų dažnis išreiškiamas
centimorganais (cM) = rekombinantinių genotipų (žymenys buvo
atskirti rekombinacijos metu) procentas.
• Vienoje sankibos grupėje esantys žymenys ~ atitinka vieną
chromosomą
M3
Minkšta
mediena
43
Sankibos
grupe Nr.1.
SSR žymenų
sistema
33
rekombinantų sk. x 100
Pvz, atstumas (cM) tapr
=
= 11% arba 11 cM
=
žymenų M1 ir M2
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
bendras medžių sk.
300
Darius Danusevičius
Nustačius QTL: tolesni žingsniai
Nustačius QTL tolesni žingsniai:
a) QTL testavimas (tikrinimas)
b) Kandidatinių genų identifikacija ir tai alternatyvių
geno/QTL formų (alelių paieška)
Tam reikalingos tikslias nukleotidų sekas
atpažįstančios žymenų sistemos:
•Gausių cDNR ir EST sekų duomenų
bazių efektyvus panaudojimas
•EST žymenys genų izoliavimui ir
klonavimui.
•EST genų polimorfizmo
nustatymas pavienių nukleotidų
polimorfizmo (SNP) ar DNR mikro
sekų metodais.
QTL
QTL
QTL
Alternatyvios vieno geno
formos (aleliai) galai skirtis tik
keliais nukleotidais:
identifikavus QTL žinoma tik
viena iš šio geno formų
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
3.3.5 QTL testavimas
•Efektyviam QTL panaudojimui selekcijoje, reikalingas QTL patikrinimas
skirtingose aplinkose, skirtingu laiku (skirtingame amžiuje) ir naudojant
skirtingas genetines linijas (šeimas).
•Be šių testavimo tyrimų, QTL tinkami naudoti tik toje aplinkoje ir su ta
šeima, su kuriais jie buvau gauti.
Nr. 1
Nr. 1
Nr. 2
Nr. 3
Nr. 4
Tėvai
Nr. 2
Nr. 1
Tėvai
Nr. 2
Tėvai
Tėvai
Palikuonys
Palikuonys
QTL
Palikuonys
?
QTL
Ar tie patys QTL (požymio ir žymenų
sąsajos) bus gauti su skirtingais
tėviniais genotipais?
QTL
Palikuonys
?
QTL
Ar tie patys QTL bus gauti išbandant
tuos pačius genotipus skirtingose
LIETUVOS MIŠKŲ
INSTITUTAS
aplinkose kelių augimo periodų
metu?
Darius Danusevičius
•Jei testavimo bandymo metu QTL nebuvo pakartotinai gauti, priežastis gali
būti per mažas QTL populiacijos dydis, todėl QTL nustatymui reikalingos
didesnės palikuonių populiacijos (ypač mažos įtakos QTL nustatymui).
•Pageidautinas mažesnis požymių kompleksiškumas: pvz. vietoje aukščio
vertinti fenologinius požymius ir fotosintetinį potencialą.
•Nepriklausomų tyrimų rezultatai turi būti įrašomi į bendrus tam tikrai rūšiai
genolapius (palyginamieji genolapiai)
•Pavyzdys: Eucalyptus grandis- keli nepriklausomi tyrimai su skirtingomis
šeimomis aptiko medienos bazinio tankio QTL homologinėse sankibos
grupėse (Grattapagia ir kt. 1996, Verhaegen ir kt. 1997).
QTL identifikacijai naudingas požymių
Genotipas A
išskaidymas siekiant prieiti kaip galima arčiau prie
Žiema (ankstyva AP
tiesiogiai požymį sąlygojančių genų. Pavyzdys
pabaiga)
dešinėje: genotipo aukštis priklauso nuo jo
sezoninio augimo trukmės: vėlesnė augimo
Šalčio
pabaiga=ilgesnis augimo laikas= didesnis aukštis. pakenkimų
Todėl pravartu ieškoti sąsajų tarp žymenų ir
rizika
augimo pabaigtos laiko, o ne medelių aukščio.
Žiema
Vasara
Genotipas B
(vėlyva AP
Šalčio
pabaiga)
pakenkimų
rizika
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
3.3.6 Miško medžių QTL identifikacijos
rezultatai
Tiksliniai požymiai:
•Adaptaciniai požymiai (fenologija, tolerancija šalčiui,
sausrai)
•Reprodukciniai požymiai (lytinė branda, žydėjimo
gausumas, lytinė asimetrija),
•Atsparumas ligoms ir kenkėjams (tolerancija aliuminiui)
•Medienos kokybė (bazinis tankis, stiebo suktumas,
gravitaciniai požymiai, cheminės savybės (celiuliozės
išeiga))
•Kiti požymiai (pvz. eglės “pendula” forma, lapų požymiai,
stiebo tiesumas, H, D, šaknydamosi energija, dauginimosi
gyvašakėmis geba)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
•Rūšys (eilės tvarka): Eukaliptas, Populus gentis, pietinės
pušys, P. eglė, p. pušis, pocūgė.
•Pagrinde naudotos selekcinių populiacijų rėmuose sukurtos
sibų šeimos: atbuline seka nuo palikuonių link tėvų.
•Naudos žymenų sistemos pradedant nuo RAPD, RFLP, AFLP,
SSR, dabartiniu metu: cDNA-AFLP, EST, SNP.
•Efektyvi tolimų populiacijų ir artimų rūšių hibridizacija.
•Pastaba: tokie požymiai kaip aukštis yra išvestiniai, kelių kitų
kiekybinių požymių išdava, todėl efektyviau sumažinti požymį
įtakojančių genų grupių skaičių (kompleksiškumą) ir ieškoti
tiesioginių genų grupių QTL.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Spygliuočių miško medžių rūšyse rasti QTL (tipiniai pavydžiai)
R ūšis
P ožym is
P inus elliottii
P inus palustris
x eliotti
P inus pinaster
alium inio tolerancija
sėjinuko aukštis
P inus radiata
P inus teada
P seudotsuga
m enziesii
P icea abies
P inus sylvestris
m egagam etofito svoris; sėklų dygim o laikas,
sėjinuko aukštis
kankorėžių skaičius; šakų kokybė, stiebo skersm uo
m edienos bazinis tankis
m edienos tankis; vėlyvos m edienos procentas,
m ikrofibrilių kam pas, ląstelės sieneles chem inė
sudėtis
ch em inės m edienos savybės
S kersm uo, aukštis
adaptaciniai požym iai
pedula form a;
aurea form a (geltoni sprogstantys ūgliai) ankstyva
lytinė branda
m edienos bazinis tankis
Ū glių lignifikacijos laipsnis, sėjinukų aukštis,
augim o pabaigos laikas
A ukštis, skersm uo, ūglių lignifikacijos laipsnis, šakų
kam pas,
K ryžm inim o schem a
(palikuonių sk.)
F 1 (186)
F 1 (72)
Ž ym enų
sistem a
RAPD
RAPD
R eferencija
F 2 savidulka (120)
RAPD
P lom ion ir kt. (1996a)
F 1 (134)
F 1 kraštu tinių genotipų
atranka
F 2 (172)
RAPD
R F LP , S S R
E m ebiri ir kt. (1997)
D evey ir kt. 2004
R A P D , R F LP
F 2 (172)
F 2(172)
F 2 (205)
R F LP
R F LP , R A P D
R F LP , R A P D
G roover ir kt. (1994),
K nott ir kt. (1997),
B row n ir kt. (2003)
N eatle ir kt. 1997
K aja ir kt. 1999
N eatle ir kt. 1997
genotipų D N R m išiniai
F 1 (73)
RAPD
E S T , A F LP ,
SSR
A F LP , S C A R
Lehner ir kt. (1995)
A chere ir kt. (2004)
RAPD
Y azdani ir kt. (2003)
A F LP
Lerceteu ir kt. 2000
įvairios šeim os ir
genotipų D N R m išiniai
F 1 (108) pietinis x
šiaurinis
F 1 (95)
K ubisiak ir kt. (1999)
K ubisiak ir kt. (1997b)
M arkussen ir kt. (2004)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Lapuočių miško medžių rūšyse rasti QTL (tipiniai pavydžiai)
R ūšis
P ožym is
K ryžm inim o schem a
(palikuonių sk.)
F 2 (186)
Ž ym enų
sistem a
R F LP , R A P D
R eferencija
C astanea dentata
x C . m ollissim a
E ucalyptus
grandis x E .
urophyla
E ucalyptus
urophyla x E .
grandis
E ucalyptus
nittens
P opulus
trichocarpa x P .
deltoides
A tsparum as sėklų ligom s, lapų dydis, ūglių
plaukuotum as, stiebo spalva
stiebo suktum as, m edienos tankis, žievės
sausas svoris, celiuliozės išeiga, geba
daugintis gyvašakėm is, ūglių šaknydinim as
m edienos tankis, stiebo nu laibėjim as,
gyvybingum as
F 1 pusiau sibai (300) ir
F 2 sibai (122)
RAPD
G rattapagia ir kt.
(1996, 1995)
F 1 (200)
RAPD
V erhaegen ir kt. (1997)
tolerancija šalčiui
F 2 (118)
R F LP
B yrne ir kt. (1997)
aukštis, skersm uo, stiebo form a, pum purų
sprogim as ir krovim as; atsparum as
dėm ėtligei; įvairūs lapų požym iai
F 2 savidulka (55) (107)
(90)
R F LP ,
RAPD, STS
A F LP ,
B randshaw ir S teffer
1995; N ew com bie ir
B randshaw 1996;
F rew en ir kt. 2000.
K ubisiak ir kt. (1997a)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
QTL rezultatai įrašomi į genolapius
LG-1(I)
LG-2(VI)
LG-3(X)
LG-4(III)
LG-5(II)
LG-6(XIII)
Height &
Diameter Age 4
Boardman,
Height &
Diameter Age 8
Clatskanie
LG-7
LG-8(V)
•Populus
Height Age 4
Height Age 1
Lateral
Clatskanie
Height Age 4
Wallula
Height Age 4
Root Length
sankibos grupių
Clatskanie,
Lateral Root
Clatskanie
Height
Age
4
Growth
Boardman,
genolapis:
Biomass Age 1
Biomass Age 1
Wallula
Height Age 4
Wallula
Diameter
kiekybinius
Clatskanie
Height Age 1
Height Age 4
Age 4
Wallula
Boardman
požymius lemia Boardman,
Height Age 4
Biomass Age 1
Height &LG-19(XII)
Clatskanie
Wallula,
Diameter Age 8
Height Age 4
vienu metu
Basal Callus
Clatskanie
Clatskanie
LG-20(XVI)
LG-23
daug genų
Height Age 4
Boardman
(QTL),
LG-30
LG-24
LG-25
LG-26
išsidėsčiusių
Biomass
LG-27
LG-28
Age 1 Wallula
Biomass
daugelyje
LG-29
Root Biomass
Age 1 Wallula
Root Biomass
Age 1 Wallula
chromosomų 0 cM
Age 1 Wallula
Biomass
Age 1 Wallula
Biomass
vietų (medžių
Age 1 Wallula
20 cM
aukščio QTL
pažymėti
LG-17
LG-10
LG-9(XI)
LG-11(XVIII) LG-12(IV) LG-13(VIII) LG-14
LG-16(XIV)
Height Age 4
raudonai)
Boardman
Height Age 4
Diameter Age 4
Boardman
Diameter Age 4
Boardman
Diameter Age 4
Boardman
Boardman
Height Age 4
Boardman
LG-15
LG-22
Height &
Diameter Age 4
LG-18
Boardman
LG-21
Root
LIETUVOS
MIŠKŲ INSTITUTAS
Initiation
Darius Danusevičius
MAS ir QTL tyrimų pasiskirstymas pagal medžių gentis (FAO
2004)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
MAS ir QTL tyrimų pasiskirstymas pagal požymius (FAO 2004)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Reprodukciniai požymiai (naudingi
selekcijai):
•Lytinė branda,
•Žydėjimo gausumas
•Lytinė asimetrija (vyriškų ir moteriškų
žiedų santykis)
Picea abies moteriškas
strobilas
•Ūglių šaknydamosi geba
Reprodukcinių požymio pavyzdys:
lytinė branda. Sėklinės kilmės
paprastosios pušies genotipas
pasiekęs lytinė brandą 9 metų
amžiuje (paprastai pasiekiam 1520 m). Nuotraukoje matomi vyriški
ir moteriški strobilai (netikri
žiedai).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
•Adaptaciniai požymiai tai požymiai turintys esminę įtaką
individų išlikimui (tuo pačiu ekonominei naudai).
•Šiaurėje vieni iš svarbiausių yra fenologiniai požymiai ir su jais
suėjusi tolerancija šalčiui ir šalnų išvengimas, pietosetolerancija sausrai.
Fenologiniai požymiai tai medžio fiziologinių
būsenų kitimo laikas metų bėgyje (augimo pradžia
ir pabaiga, ramybės būsena, ūglių sumedėjimo
lapsnis, ramybės būsenos praradimas)
a) anksti pradėjęs
sezoninį augimą
šiaurinės Lietuvos p.
eglės genotipas
pakenktas pavasarinių
šalnų
b) iš šaltesnio klimato
atkelti p. eglės genotipo
pradeda augimą
anksčiau nei vietiniai.
a)
b)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Medienos kokybės požymiai (naudingi selekcijai):
•Medienos bazinis tankis (kietumas)
•Tracheidžių ilgis, mikrofibrilių kampas
•Celiuliozės išeiga
•Cheminės savybės
Mikrofibrilių kampasvidutinis celiuliozės
molekulių kampas
ląstelės sienleje
Density (kg/m3)
200 400 600
Medienos Bazinis
tankis priklauso
nuo ląstelių
sienelės storio;
vėlyvos
medienos
(formuojamos
augimo sezono
pabaigoje)
ląstelių sienelės
yra storesnės
Tracheidžių ilgis
0
50
100
Distance (x 25µm)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Rezultatų apibendrinimas
•Rezultatus galima sisteminti pagal tokius kriterijus:
– Požymį sąlygojančių QTL skaičius ir QTL įtakos
stiprumas (kiek QTL sąlygoja požymį ir kokia QTL įtaka
požymio išraiškai?),
– Įvairių požymių QTL išsidėstymas genome
(chromosomose) (ar panašių požymių QTL yra netoli
vienas kito?),
– QTL išraiškos stabilumas (ar pakartojus tyrimą su ta
pačia medžiaga bus gauti tie patys QTL?).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Požymio QTL skaičius ir įtaka
•Nors teoriškai kiekybiniai požymiai sąlygojami daugelio geno, rastas
stebėtinai mažas tam tikro požymio QTL skaičius (vidurkis 2,7 QTL per
požymį)
•QTL sąlygotas fenotipinio požymio kintamumo procentas vyravo nuo 4 iki
63 %= pagrinde rasta nedaug bet svarios įtakos QTL,
•Daugumai poligeninių požymių tokias išvadas sunku pritaikyti,
•Priežastis sąlyginai mažos (<150) palikuonių QTL tyrimo populiacijos
(dėl aukštų DNR tyrimų kaštų) = buvo aptiktas mažesnis QTL skaičius nei
iš tikrųjų bei jų įtaka fenotipiniams požymiams gauta didesnė nei iš tikrųjų
•Todėl, galutinės išvados dėl QTL skaičiaus ir įtakos darytinos tik po
tolesnių QTL testavimo tyrimų
Apibendrinimas paveiksle: tam tikrą požymį sąlygojantys QTL ir jų įtaka fenotipiniam požymiui
Nustatytas tyrimais QTL skaičius
Tikėtinas QTL skaičius
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
QTL išsidėstymas chromosomose
•Principas: ta pati QTL nustatymo populiacija tiriama skirtingais žymenimis ir
vertinami įvairūs fenotipiniai požymiai
•Rezultatai:
•Pagrinde, fenotipiškai susijusių požymių QTL buvo vienodose ar netolimose
sankibos grupėse
•Jei QTL įtaka vienoda= vienas genas koduoja baltymą, kuris yra nors ir
nevienodai bet reikalingas abiem požymiams,
•Jei QTL įtaka skirtinga: du susiję genai ar kitą bet susijusį požymi
sąlygojantys genai.
•Jei fenotipiškai nesusijusių požymių QTL buvo susiję= pleotropija- vienas genas
įtakoja kelis požymius.
•Pavydžiai: Eucalyptus (lapo plotas-H; medienos kietumas-stiebo suktumas-žievės
masė), Castanea (ūglių plaukuotumas-stiebo spalva); Populus (įvairūs lapų
požymiai)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
QTL išraiškos stabilumas (1)
•QTL aptikimas ir išreikštumas priklauso nuo laiko, aplinkos
ir genetinių faktorių
•Laiko faktoriai: genai įjungiami tam tikrame medžių
ontogenezės etape (pvz. lytinės branda)
•Aplinkos faktoriai: aplinka inicijuoja tam tikrų genų
įjungimą (pvz. pumpurų ramybės būsena ar sezoninio
augimo pradžia)
•Genetiniai faktoriai: kai kurie QTL būdingi tik tam tikrai
šeimai; todėl vertingiausia QTL aptikti keliose šeimose
•Stiprios įtakos QTL greičiausiai yra genai įjungėjai,
priimantys aplinkos signalus ir inicijuojantys kitų genų grupių
veiklą (pvz. sezoniniai medžių fiziologinės būsenos pokyčiai)
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
QTL išraiškos stabilumas (2)
•QTL nebuvo pakartotinai aptikti vienoje QTL populiacijoje:
Aukštis (H) ir skersmuo (D) kelių augimo periodų (AP) metu (Populus,
Pinus taeda),
Priežastys: vieno AP metu aptikti susijusių požymių QTL, kurie dėl kitokių
aplinkos sąlygų ar fiziologinės būsenos buvo kitaip išreikšti ir turėjo
kitokias sąsajas su medžių H ir D kito AP metu (= reikalinga mažiau
kompleksinių požymių analizė, pvz. augimo ritmas vietoje aukščio)
•Buvo aptikti kelių augimo periodų metu:
Lapų dėmėtligė (Populus), jaunų sėjinukų aukštis (Pinus pinaster),
medienos tankis (Eucalyptus, Pinus taeda), pumpurų sprogimas
(Pseudotsuga menziesi)
•Išvada: didesnis QTL stabilumas rastas adaptaciniams požymiams
(priežastis= aukštesnis paveldimumas) ir rezistentiškumo kenkėjams
požymiams (mažesnis kompleksiškumas).
•Patikima strategija: kandidatinių genų paieška ir jų STS ar EST žymenų
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
gamyba ir naudojamas selekcijoje
Darius Danusevičius
QTL išraiškos stabilumas (3)
•Požymio ir QTL sąsaja gali žymėti ir su tuo požymiu susijusių kitų požymių
QTL
•Pavyzdžiui: kadangi medžių medienos bazinis tankis (medienos kietumas)
yra susijęs su jų sezoninio augimo pabaigos laiku, QTL susijęs su medienos
kietumu gali būti ir genų atsakingų už augimo terminaciją dalis.
•Metinė rievė susideda iš ankstyvosios (minkštos) ir vėlyvosios (kietos)
medienos.
•Augimui į aukštį pasibaigus, medis tebeauga į skersmenį, suformuodamas
vėlyvąja medieną; kuo ankstesnė augimo pabaiga tuo daugiau formuojama
kietesnės vėlyvosios medienos.
Perkelti į pietus, šiauriniai
genotipai sustoja augti į H G egužes 1d.
anksčiau, todėl priaugina
P ietin is
< minkštos ankstyvos
gen otip as
medienos ir > vėlyvos
(kietos) medienos.
G egužes 1d.
Š iau rin is
gen otip as
L iepos 1d.
L iepos 1d.
R ugpjūčio 1d.
R ugpjūčio 1d.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
3.3.7 Kandidatinių genų paieška
•Tikslas sumažinti atstumą tarp žymenų ir QTL bei identifikuoti QTL
genus.
•Kandidatiniai genai tai sekvenuoti genai, kurie gali įtakoti požymio
išraišką (t.y. genai sąlygojantys tikslius biocheminių procesus, pvz.
enzimas kanalizuojantis lignino monomerų jungtis).
•Potencialūs kandidatiniai genai gali būti identifikuojami panaudojant
žinomus QTL žymenis ir specifinių audinių cDNR bibliotekas bei
naudojant tinkamas cDNR sekas kaip geno žymenis:
•įprastinėse QTL analizėse, geno efektui nustatyti.
•alternatyvių alelių sąsajų su požymiais tyrimus klonų archyvuose
ar kitose polimorfinėse populiacijose= pagrindinių genų (t.y. genų,
kurių polimorfizmas turi esminę įtaką fenotipui) paieška.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Pagrindiniai paieškos principai
1. Kandidatinius genus žyminčių žymenų kūrimas: genų ekspresijos tyrimas
 polimorfinių cDNR identifikacija  sekų nustatymas  atitikmenų
paieška bibliotekose  geną žyminčių žymenų kūrimas (EST ar STS)
Polimorfinių cDNR nusatymas
Sekvenavimas
cDNR atitinkančių genų paieška
bibliotekose
Specifinės sekos žyminčios abi geno
puses naudojamos kaip žymenys
cDNR
GTATAGGTCTCTGT
Kandidatinio
geno seka
2. Kandidatinius genus žyminčių žymenų naudojimas geno ir požymio
sąsajai patikrinti ir polimorfinių geno formų (alelių identifikacijai)
Žymenų naudojimas
geno patikrinimui (geno
sąsajos su fenotipiniu
požymiu patikrinimas) ir
polimorfizmo studijos
QTL
kelių populiacijų ir keliolikos šeimų
bandymai
QTL
QTL
Alternatyvios vieno geno formos (aleliai) galai
skirtis tik keliais nukleotidais:
identifikavus
LIETUVOS MIŠKŲ
INSTITUTAS
Darius
QTL žinoma tik viena
išDanusevičius
šio geno formų
Klonų archyvas: alelių “kasykla”
Klonų archyvai (genotipų kopijų kolekcijos) ir tolimų populiacijų bandymai gali
tarnauti kaip puiki medžiaga įvairių žinomo geno formų alelių identifikacijai.
Kadangi šiuose bandymuos sukaupta nemaža dalis rūšiai atstovaujančios
genetinės įvairovės.
Žinant geno sekas (ar jo dalies sekas iš EST bibliotekų) šie archyvai gali būti
naudojami kaip alternatyvių šio geno formų (alelių) “kasyklos”
Pinus sylvestris klonų archyvas
Alternatyvios
vieno geno
formos gali
skirtis
nedideliu
sekų
skaičiumi
Skirtingų klonų DNR molekulės su poligenais
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
SNP žymenų taikymas (1)
• SNP ir juos žyminčios specifinės gretimos DNR
nukleotidų atkarpos randamos:
a) sekvenuojant polimorfinius PCR fragmentus,
pagausintus naudojant EST žymenis
polimorfinėse populiacijose (kilmės, klonų
archyvai)
b) analizuojant cDNR sekų duomenų bazėse
esančias genų sekas (vadinami eSNP).
Paprastai SNP randamas kas 1000-2000
nukleotidų.
CTCAGACA
GAGTCTGT
EST žymenys (PCR pradai)
identifikuojantys geną
PCR pagausimas ir
sekvenavimas
CTCAGACA
GAGTCTGT
• Žinant SNP vietą žyminčias DNR atkarpų sekas,
tolesnis SNP taikymas ženklai palengvėja
naudojant DNR mirko sekas ar PCR ir
automatinio sekvenavimą.
Toliau SNP identifikuojami pagal tam
pagamintus žymenis (specifines DNR
sekas abiejose SNP šonuose) ir
naudojami geno polimorfizmo paieškoje
Išreikšto geno dalis
(cDNR dalis)
Polimorfinės
populiacijos genotipų
analizė ir SNP atradimas
QTL
Genotipas A
QTL
Genotipas B
CTCATACA
GAGTATGT
SNP žymuo
QTL
SNP žymuo
Vieno nukleotido pokytis
CTCAGACA
GAGTCTGT
SNP žymuo
SNP žymuo
Vieno
nukleotido
pokytis
LIETUVOS
MIŠKŲ
INSTITUTAS
Darius Danusevičius
SNP žymenų taikymas (2)
1. SNP žymenų naudojimas geno (cDNR) polimorfizmo nustatymui
polimorfinėje populiacijoje.
Polimorfinės
populiacijos
pavyzdys: Pinus
sylvestris klonų
archyvas
SNP žymenys
Išreikštų skirtingų fenotipų atranka
polimorfinėje populiacijoje (klonų
archyvas ar tolimų populiacijų bandymas)
2. PCR produktų sekvenavimas ir SNP polimorfizmo nustatymas
Ypač efektyvus metodas svarių genų (major genes) identifikavai (t.y. genų kurių polimorfizmas turi
esminę įtaką fenotipinio požymio išraiškai); būtent svarių genų nustatymas naudingas selekcijai.
G en otip as A
G en otip as B
CTCATACA
GAGTATGT
S N P žy m uo
Elektroforezės gelis
Bakterijos Sekvenatorius
Alternatyviai naudojama hibridizacija su
žinomų genų cDNR DNR mirko gardelėse
S N P žy m uo
V ieno nukleotido poky tis
CTCAGACA
GAGTCTGT
S N P žy m uo
V ieno nukleotido poky tis
Fragmentai izoliuojami iš gelio ir terpiami į bakterijų
plazmides (saugojimui) ir sekvenuojami taip nustatant
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
SNP polimorfizmą, kuris lyginamas suDarius
fenotipu.
Danusevičius
Miško medžių klonų archyvai
Miško medžių klonų archyvai tai sistematikiškai išdėstyti
genotipų kopijų želdinai, skirti vertingų genų išsaugojimui
Du skirtingo šakojimosi tipo klonai
paprastosios eglės klonių archyve
(genus žymintis požymis – šakojimosi
tipas) (Šlėnava)
Poskiepis ir įskiepis genetiškai
skirtingi ir pradega augimą
skirtingu laiku: genus žymintis
požymis pumpurų sprogimo
LIETUVOS MIŠKŲlaikas
INSTITUTAS
Darius Danusevičius
3.3.8 QTL naudojimas selekcijoje
Molekulinių žymenų, patikimai susijusių su tam tikrais
požymiais, naudojimas atrenkant individus vadinamas
atranka žymenų pagalba (ang. marker assisted selection
(MAS)).
Pavyzdys: reikia atrinkti kietos medienos genotipus jauname
amžiuje
Lauko bandymas: kuris iš jaunų
medelių turės kietą medieną?
B
A
Žymuo, susijęs
su QTL
A
QTL geno vieta
chromosomoje
Laboratorinių DNR tyrimų rezultatas:
elektroforezės gelis
C
QTL žymuo naudojamas
laboratorinėse analizėse,
kurių rezultate nustatomi
požymiui specifiniai DNR
fragmentai
A
B
C
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
MAS nauda selekcijoje
Pavyzdys: medžių aukštis, sąlygojamas 4 genų, kurių reikšmė
išreikšta skaitine verte; požymio vertes įtakoja aplinka taip
suformuodama fenotipą
Matoma vertinant: žymenų sąsajos su
QTL ir fenotipo matavimo duomenys
Reali padėtis: žinomos genų vertės, genotipas,
aplinka ir fenotipas
B
1
1
2
5
C
1
1
3
9
7
9
12
+6
+5
-5
13
14
7
2
4
1
4
1
1
2
5
3
1
3
15
16
9
15
-6
+7
+4
Fenotipas
4
Aplinka
1
Fenotipas
1
Aplinka
1
Genotipas
A
Genotipas
QTL
QTL
13
17
7
Poligenai
Informacija apie žymenų sąsają su QTL ženkliai padidintų
atrankos efektyvumą (padėtų identifikuoti pranašius
individus).
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
MAS efektyvumas
•Tam, kad nustatyti QTL ir panaudojimo galimybės tam
tikroje selekcinėje populiacijoje, galima kryžminti QTL
nustatymui naudotą šeimą su visos selekcinės populiacijos
narių žiedadulkių miškiniu ir sekti QTL žymens
rekombinacijos dėsningumus palikuonyse
•QTL panaudojimas efektyviausias žemo paveldimumo
požymiams arba požymiams kurių nustatymui riekia daug
laiko (reprodukciniai požymiai, medienos kokybė)
•Jei žinomi dviejų požymių žymenys, efektyvu juos
panaudoti nustatant kurie iš palikuonių paveldėjo abu
požymius kontroliniuose kryžminimuose
•Rastam QTL suteikiamas svorinis indeksas pagal procentą
paaiškinto tikslinio požymio kintamumo.
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
Literatūros sąrašas
•Bahrman N, Damerval C (1989) Linkage relationships of loci controlling protein amounts in maritime pine (Pinus pinaster Ait.).
Heredity 63: 267-274
•Binelli G, Bucci G (1994) A genetic linkage map of Picea abies Karts., based on RAPD markers, as a tool in population genetics.
Theor Appl Genet 88: 283-288
•Benfey, P. 2004. Essentials of Genomics. Prentice Hall ISBN: 0130470198.
•Cato, S.A, Gardenr, R.C., Kent, UJ., Richardson T.E. 2001. A rapid PCR-based method for genetically mapping ESTs. Theoretical
and Applied Genetics 102: 296-306.
•Carlson JE, Tulsieram LK, Glaubitz JC, Luk VWK, Kauffeld C, Rutledge R (1991) Segregation of random amplified DNA markers
in F1 progeny of conifers. Theor Appl Genet 83: 194-200
•Devey ME, Bell JC, Smith DN, Neale DB, Moran GF (1996) A genetic map for Pinus radiata based on RFLP, RAPD and
microsatellite markers. Theor Appl Genet 92: 673-679
•Devey ME, Fiddler TA, Liu BH, Knapp SJ, Neale BD (1994) An RFLP linkage map for loblolly pine based on a three-generation
outbred pedigree. Theor Appl Genet 88: 273-278
•Falconer, D.S. and Mackay, T. F.C. 1996. Introduction to Quantitative Genetics (4th Edition). Prentice Hall, ISBN: 0582243025.
•FAO, 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic modification. Forest Genetic Resources Working
Paper FRG/59E, Forestry Department, FAO. Rome, Italy.
•Grattapaglia D, Sederoff R (1994) Genetic linkage maps of Eucalyptus grandis and E. urophylla using a pseudo-testcross
mapping strategy and RAPD markers. Genetics 137: 1121-1137
•Grattapagia, D.F., Bertolucci, R., Pencher, R., Sederoff, R. 1996. Genetic mapping of QTLs controlling growth and wood quality
traits of Eucalyptus grandis using a materal half sib family and RAPD markers. Genetics 144: 1205-1214.
•Harry DE, Neale DB (1994) PCR-based genetic markers for loblolly pine developed from cloned cDNAs. The International
Conference on the Plant Genome II, 24-27 january. San Diego, CA poster # 76
•Hutchison K, Singer P, Volkaert H, Deker A, Costello L, Greenwood M (1994) A PCR-based molecular genetic map for the
conifer Larix decidua. The International Conference on the Plant Genome II, 24-27 january. San Diego, CA poster # 90
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
Darius Danusevičius
•Kumar, S. and Fladung, M. 2004. Molecular Genetics and Breeding of Forest Trees. Food Products Press, ISBN: 1560229594.
•Krutovskii, K.V., Neale, D. B. Forest genomics for conserving adaptive genetic diversity. Forest Genetic Resource Working Paper
FGR/3(E), FAO, Rome Italy.
•Liu, B.-H. 1998. Statistical Genomics: linkage, mapping and QTL analysis. CRC Press, New Yourk.
•Lehner A, Campbell MA, Wheeler NC, Pöykkö T, Glössl J, Kreike J, Neale DB (1995) Identification of a RAPD marker linked to
the pendula gene in Norway spruce (Picea abies (L.) Karst. f. pendula). Theor Appl Genet 91: 1092-12094
•Mei-Ling Ting Lee. 2004. Analysis of Microarray Gene Expression Data. ISBN: 0792370872. Springer.
•Michelmore R, Paran I, Kesseli RV (1991) Identification of marker linked to disease resistance gene by bulk segregant analysis
: a rapid mathod to detect markers in specific genomic regions using segregating populations. Proc Natl Acad Sci USA 88:
9828-9832
•Paran I, Michelmore RW (1993) Development of reliable PCR-based markers linked to downy resistance genes in lettuce.
Theor Appl Genet 85: 985-993
•Paterson, A. H. 1997. Molecular Dissection of Complex Traits. CRC-Press; 1 edition ISBN: 0849376866.
•Paterson, A. H. 1995. Molecular Dissection of Quantitave traits: Progress and Prospects. Genome Research 3: 321-333.
•Plomion C, Bahrman N, Durel C-E, O'Malley DM (1995a) Genomic mapping in Pinus pinaster (Maritime pine) using RAPD and
protein markers. Heredity 74: 661-668
•Sewell, M.M, Neatle, D. 2000. Mapping quasntitative trait sin forest trees. In: Molecular biology of woody plants. Forestry
Sciences, Vol. 64 (S.M. Jain and S.C. Minocha eds.) pp. 407-423.
•Sliesaravičius, A ir Stanys, V. 2005. Žemės ūkio augalų biotechnologija. Enciklopedija, Vilnius, ISBN 9986-433-36-3.
•Smith DN, Devey ME (1994) Occurrence and inheritance of microsatellites in Pinus radiata. Genome 37: 977-983
•Wakamiya I, Newton RJ, Johnston JS, Price HJ (1993) Genome size and environmental factors in the genus Pinus. Am J Bot
80: 1235-1241.
•Wilcox PL (1995) Genetic dissection of fusiform rust resistance in loblolly pine. Ph D thesis, North Carolina State University,
125p
•Verhaegen, D.C., Plomion, J-M., Gion, M. Kremer, A. 1997. Quantitative trait dissection analysis in Eucalyptus using RAPD
markers. Theor. Applied Genetics 95: 597-608.
•Yazdani R, Yeh F, Rimsha J (1995) Genomic mapping of Pinus sylvestris (L.) using random amplified polymorphic DNA
LIETUVOS MIŠKŲ INSTITUTAS
markers. For Genet 2: 109-116
Darius Danusevičius