Transcript 3.5 Genų ekspresijos analizė
Slide 1
3.5 Genų ekspresijos analizė
DNR mikrogardelės:
-principas
-galimybės
-taikymas
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 2
1. Struktūrinė genomika:
Genomo sekvenavimas ir išreikštų
sekų žymenys (EST)
2. Funkcinė genomika:
• Genų pasireiškimo nustatymo būdai:
Mikro-gardelės ir DNR sekų
nuskaitymo profiliavimas
• Įterpimo mutagenezė
• Atskiro nukleotido polimorfizmo
(SNP) žymėjimas genolapyje
• Genolapiu paremtas sugretinimas
(angl. map-based cloning)
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
http://www.genetik.uni-bielefeld.de/MolMyk/treffen/work2/bioinformatikworkshop/
Slide 3
BIO technologijos
(genomika)
NANO technologijos
(mikrogardelių lustai)
INFORMACINĖS
technologijos
Tyrimai mikrogardelių pagalba
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 4
Centrinė molekulinės biologijos dogma
DNR
replikacija
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
RNR
Baltymai
transkripcija
transliacija
(RNR sintezė)
(baltymo sintezė)
Slide 5
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 6
Tradicinė biologija:
Ieško genų, kurie skirtingai pasireiškia
Tiria šių genų funkcijas
Nustato tiriamo geno sąveiką su kitais genais
Tyrimai paremti mikrogardelių principu:
Galima masinė paralelinė genų ekspresijos analizė
Nedidelį genomą galima tirti visą iškart
Nustato ne tik atskirus besiskiriančius genus, bet ir besiskiriančias genų grupes
Analizė parodo santykinio ekspresijos lygio skirtumus
Analizuoti galima ne tik atskirą molekulę, bet ir jų kompleksus
Efektyvi funkcinė genų analizė
Galima identifikuoti reguliacinius ir ląstelių procesus
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 7
DNR mikrogardelės, taip pat vadinama genų lustais (angl. DNA
chips, DNA arrays, DNA microarrays), yra funkcinės genomikos
metodas, skirtas diagnostikai, mutacijų ir polimorfizmo suradimui,
genų paieškai, genų ekspresijai tirti bei genolapių kūrimui. (detalesnė
informacija Gibson 2002)
Jau daugiau nei dešimtmetį (nuo 1995 m.)
gyvuoja DNR mikrogardelių technologija,
kurią naudojant galima vienu metu tirti visų
organizmo koduojamų genų ekspresiją. Tai
vienas iš efektyviausių genomo tyrimo
metodų ir jo atsiradimas buvo sąlygotas
didėjančio sekvenuotų genomų skaičiaus bei
poreikio tirti įvairių organizmų genų
funkcionavimą.
DNR gardelių metodas panaudotas žmogaus
genų ekspresijos sveikuose audiniuose
įvertinimui. Gauti transkripcijos lygio
standartai naudojami patologinių procesų
nustatymui.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 8
DNR mikrogardelių principas
GACTGAACGT
Nežinoma
||||||||||
CTGACTTGCA
T
C
A
G
TAGGC T G
T
Žinoma
T
GC
T
C
TA
ATCCGACAATGACGCC
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
• Vertinimas nežinomos DNR (susintetinta
atvirkštinės transkriptazės pagalba nuo iš
ląstelės išskirtų mRNR) panaudojant
hibridizaciją.
• Žinoma DNR yra taškuojama ant
plokštelės.
• Pažymėta nežinoma DNR suliejama su
žinoma DNR ir vyksta hibridizacija.
• Plokštelė yra nuplaunama ir skenuojama.
http://www.biology.washington.edu/fingerprint/
Slide 9
Suformuotos mikrogardelės talpina
tūkstančius skirtingų DNR
pavyzdžių.
Gardelės gali būti formuojamos ir
tiesiai ant aktyvuoto stiklo paviršiaus
sintetinant oligonukleotidus. Tai
dažniau naudojamas būdas.
Oligonukleotidai (tai paprastai tai 2030 nukleotidų vienguba grandinė)
naudojami komplementarios DNR
segmentų suradimui.
Genų ekspresijos lygis (t.y. žymėtos mRNR kiekis prisijungęs prie
mikrogardelėse esančios DNR) įvertinamas kompiuterinių programų
pagalba, lyginant fluorescencijos signalų raiškumą. Tai kiekybinė
analizė.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
www.bioalgorithms.info
Slide 10
DNR mikrogardelės (taškinės gardelės)
1) Gardelės suformuojamos iš
reikiamų cDNR fragmentų
2) Panaudojamas didelio
tikslumo automatinis
taškavimas
3) cDNR taškuojama ant
mikroskopo stiklo plokštelių
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 11
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 12
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 13
DNR gardelių technologijos
Gardelės
tipas
Taškų tankis
(1 cm2)
Zondas
Mėginys
Žymėjimas
Nailono
makrogardelės
<100
cDNR
RNR
Radioaktyvus
Nailono
mikrogardelės
<5000
cDNR
mRNR
Radioaktyvus/
Fluorescencinis
Stiklo
mikrogardelės
<10000
cDNR
mRNR
Fluorescencinis
Oligonukleotidų
Gardelės
<250000
oligonukleotidai
mRNR
Fluorescencinis
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
www.eng.uiowa.edu/~tscheetz/doc/CLCG/PPT
Slide 14
Kiekvienoje mikrogardelėje
(dydis maždaug 100um) yra
PCR sekvenuotos DNR sekos
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
http://www.bioinfbook.org
Slide 15
ACTGC
ACTGC
ATCCGACAATGACGCC
Visiškas atitikimas
ACTGC
ATCCGACAATGACGCC
Mažesnis atitikimas
ATTCC
ATCCGACAATGACGCC
ACCCC
ATCCGACAATGACGCC
Mažas atitikimas
Hibridizacijos principas yra
panaudojamas genų ir jų ekspresijos
nustatymui, o taip pat DNR sekų
atitikimo palyginimui.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Fluorescenciškai pažymėti mėginiai
hibridizacijos proceso metu jungiasi prie
mikrogardelių DNR
www.bioalgorithms.info
Slide 16
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 17
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
http://www.fao.org/DOCREP/003/X6884E/
Slide 18
Taškinės mikrogardelės metodu (angl. spotted or two-channel microarrays)
negalima nustatyti absoliučios geno veiklos išraiškos
Genas 1
Genas N
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 19
Oligonukleotidų mikrogardelės (angl. oligonucleotide or single-channel
microarrays) metodu (iš dešinės) galima nustatyti absoliučią geno veiklos išraišką
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 20
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 21
Duomenų analizė
1) Atskirų genų analizė
Absoliučios reikšmės gali būti klaidinančios.
Reikalingas atskaitos taškas (kontrolė) tam, kad būtų galima statistiškai
įvertinti atskiro geno ekspresijos patikimumą. Naudojamas
vidurkis/nukrypimas patikimumo įvertinime.
2) Ko-ekspresijos analizė
Panašiai išreikštų (ekspresuotų) genų paieška
eksperimentas 1
Genas i:
eksperimentas 2
eksperimentas 3
(x1,x2,x3,…) Tai šio geno ekspresijos profilis
x1,x2,x3,.. paprastai yra logaritminėje skalėje
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 22
Genų p ekspresijos duomenys mėginiuose n
iRNR mėginiai
mėginys1 mėginys2 mėginys3 mėginys4 mėginys5 …
Genai
1
2
3
4
5
0.46
-0.10
0.15
-0.45
-0.06
0.30
0.49
0.74
-1.03
1.06
0.80
0.24
0.04
-0.79
1.35
1.51
0.06
0.10
-0.56
1.09
0.90
0.46
0.20
-0.32
-1.09
...
...
...
...
...
Geno i ekspresijos lygis iRNR mėginyje j
=
V.Baliuckas
Log( Raudonos sp. intensyvumas / Žalios sp. intensyvumas)
Log(Vidurkis PM - Vidurkis MM)
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 23
Mikrogardelių panaudojimas
Genų ekspresijos analizė:
Ieško genų skirtumų
Tiria atsaką į aplinkos faktorių įtaką
Ligų eigą ir vykstančius procesus
Vaistų poveikį
DNR sekų variacijos nustatymas:
Genetinis charakterizavimas
Somatinių mutacijų aptikimas
Tiesioginis sekvenavimas
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 24
DNR mikrogardelės gali būti naudojamos konkrečiose chromosomų vietose esančių
genomo sekų nuskaitymui ir vertinimui. Atskiro nukleotido polimorfizmo (SNP)
mikrogardelės naudojamos individų ar tarppopuliacinės genetinės variacijos nustatymui.
Trumpų oligonukleotidų gardelės gali būti naudojamos atskiro nukleotido polimorfizmo
identifikavimui, tam kad patikrinti jo įtaką genetinei įvairovei ar genetiškai užkoduotą
polinkį įvairioms ligoms.
Palyginti neseniai pradėtas naudoti DArT (angl. Diversity Array Technology) metodas
genetinio polimorfizmo nustatymui (žr. Jaccoud et al. 2001). Gali būti taikomas grupės ar
pavienių individų tyrimams, atitinkamai formuojant tiriamuosius mėginius.
DArT taikymo procesas susideda iš 4 pagrindinių dalių:
polimorfinės gardelės (angl. diversity panel) formavimas iš genetiškai įvairios grupės
individų genominės DNR
tiriamųjų mėginių formavimas ir jų fluorescencinis ženklinimas (Cy3 ir Cy5)
hibridizacija tiriamųjų mėginių su polimorfine gardele
plokštelių skenavimas ir analizavimas
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 25
Preliminarus žymenų sistemų lyginimas analizuojant manijoko genetinės
įvairovės struktūrą
SSR: 36 SSR žymenys
DArT: gardelė iš ~1000 klonų
•Kodominantiniai žymenys
•Dominantiniai žymenys
•Labai polimorfiniai
• Vidutiniškai polimorfiniai
•Paruošimo kaina
• Paruošimo kaina
~36000 US$ (36 žymenims)
~20000 US$ gardelei (1000
polimorfinių genų klonų)
•Žemas našumas
•Didelis našumas
•Genetinės informacijos kaina
/lokusas /genotipas: 0.5 US$
• Genetinės informacijos kaina
/lokusas /genotipas: 0.025 US$
DArT metodas yra nepriklausomas ar nesiremia informacija apie DNR sekas. Gali
būti taikomas genų bankų kolekcijoms vertinti, nes padengia didelę genomo dalį
(mikrogardelių metodo naudojimas SNP tarp genotipų vertinimui, yra kol kas per
brangus platesniam taikymui).
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
http://www.generationcp.org/vw/Download/ARM_2004/
Slide 26
EST duomenų bazės
Eksperimento
dizainas
Tiriamos medžiagos parinkimas
Mėginių paruošimas
Žiurkė
Mikrogardelės
dizainas
Pelė
Klonų pergrupavimas
Plokštelės
paruošimas
Žmogus
Mikrogardelių
duomenų bazė
Pušis
Hibridizacija
Kompiuterinė analizė
Kitos duomenų bazės
Duomenų
bazė 1
Koordinuota
genų
ekspresija
Duomenų
bazė n
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Ekspresijos
skirtumų
analizė
Statistinė
analizė
Gauto vaizdo
pavertimas
kiekybiniais
duomenimis
Slide 27
Duomenų gavimas eksperimentuose naudojant
mikrogardelių metodus
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 28
MIAME duomenų bazė (minimumas informacijos apie
mikrogardelių eksperimentą)
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 29
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Eichinger 2005
Slide 30
Duomenų normalizavimas
(išsibarstymo sumažinimas ir variacijos
suvienodinimas tarp pakartojimų)
Klasteriavimas
T-testai
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 31
• Kiekvienam genui apskaičiuojama vidutinė išraiška (kontrolinio ir bandomo varianto)
• Nulinė hipotezė: abu variantai nesiskiria
• Slenkstinė t-testo reikšmė paprastai imama p<0.05
• Tinkamą p reikšmę reikia koreguoti, priklausomai nuo tiriamų genų skaičiaus (kuo
didesnis genų skaičius, tuo mažesnė p reikšmė parodo esminius skirtumus)
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 32
Sample 1
Sample 2
Gene 1
1.04
2.08
Gene 2
3.2
10.5
Gene 3
3.34
1.05
Gene 4
1.85
0.09
Kiekybinė analizė
Klasterių sudarymas
(hierarchinis, k-vidurkių)
Prižiūrima, neprižiūrima analizė
(angl. supervised, unsupervised)
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Principinių komponenčių
analizė
Automatinis grupavimas
(angl. self-organising maps)
Slide 33
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Clarke and Zhu (2006)
Slide 34
SAS programa tipinei DNR mikrogardelių analizei:
y ijk a j d i a d ij e ijk
proc mixed data=duomenys;
class dye array;
model signal = dye / outp=rrr;
random array array*dye;
lsmeans dye/ pdiff;
run;
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 35
Mikrogardelių eksperimentų privalumai
Našumas
>20 000 genų per 1-4 savaites
Apimtis
Mielių ar pelės genomas telpa į vieną gardelę
Pritaikomumas
Kuo daugiau genomų sekvenuota, tuo daugiau gardelių gali būti
pagaminta. Atskiram atvejui galima kurti unikalias gardeles.
Praktiškumas
Neribojamas RNR pavyzdžių technologinei įrangai pateikimas
Ekonomiškumas Gardelės suformavimas 20 000 genų kainuoja apie 350$
Mikrogardelių eksperimentų trūkumai
Kaina
Kai kuriais atvejais mokslininkams yra per brangu naudoti reikiamus
kontrolinius variantus ar pakartojimus.
RNR
reikšmingumas
Genų ekspresijos galutinis produktas yra baltymas.
Kokybės kontrolė Neįmanoma atskirus elementus įvertinti ant gardelės paviršiaus.
Įvairūs iškraipymai skenuojant gardelę ar analizuojant duomenis (angl.
artifacts).
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 36
Genomika/proteomika yra labiausiai besivystančios sritys miško biotechnologijoje.
Tikėtina, kad visas genomas ar didžioji dalis išreikštų genų sekų bus artimiausiu metu
gauta, be Populus trichocarpa, dar bent 2 miško medžių rūšims – tai Pinus taeda ir
Eucalyptus globulus. Tada dar labiau suintensyvės funkcinės genomikos vaidmuo
(mikrogardelių taikymas, modelinių medžių rūšių lyginimas su tiriamomis, genetinių
modifikacijų tyrimai). Didelės EST bibliotekos bus naudojamos kandidatinių genų
tyrimuose, ypač padaugėjus modelinių medžių rūšių su pilnais fiziniais ir genetiniais
genolapiais. Lyginamoji genomika ir jos taikymas gali pasiekti ne tik rūšies, genties, bet
net ir šeimos lygį. Kartu su fundamentaliaisiais tyrimais išaugs ir taikomųjų tyrimų
apimtys. Kartu su tradicine medžių selekcija bus taikomi siejamosios (angl. association)
genetikos metodai, identifikuojant norimus genų alelius. Vis daugiau genų bus
identifikuojama genetinių modifikacijų tyrimuose.
Ateityje oligonukleotidų pagrindu sudaromos mikrogardelės, kaip duodančios
patikimesnius rezultatus, matomai keis klonų pagrindu sudaromas, nežiūrint to, kad
pastarosios yra mažiau kainuojančios. Taip pat galima laukti didesnio mikrogardelių
panaudojimo miško medžių selekcijoje.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
www.fao.org/biotech/
Slide 37
Literatūros sąrašas
Baldi P. and Hatfield G.W. 2002. DNA Microarrays and Gene Expression, Cambridge.
Bretz F., Landgrebe J. and Brunner E. 2003. Efficient design and analysis of two color
factorial microarray experiments. Biostatistics.
Clarke J.D. and Zhu T. 2006. Microarray analysis of the transcriptome as a stepping
stone towards understanding biological systems: practical considerations and
perspectives. The Plant Journal 45: 630–650.
Mount D.W. 2004. Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis. 2nd Edition, Cold
Spring Harbor, p. 692.
Gibson G. 2002. Microarrays in ecology and evolution: a preview. Molecular Ecology
11:17–24.
Jaccoud D., Peng K., Feinstein D. and Kilian A. 2001. Diversity arrays: a solid state
technology for sequence information independent genotyping. Nucleic Acids Research
29.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 38
FAO. 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic
modification. Forest Genetic Resources Working Paper FGR/59E. Forest Resources
Development Service, Forest Resources Division. Rome, Italy.
Kohane I.S. et al. 2002. Microarrays for an Integrative Genomics. MIT Press,
Cambridge, MA.
McLachlan G.J., Do K-A., Ambroise C. 2004. Analyzing Microarray Gene Expression
Data. Hoboken, NJ: Wiley.
Spooner D., van Treuren R. and de Vicente M.C. 2005. Molecular markers for genebank
management. IPGRI Technical Bulletin No. 10. International Plant Genetic Resources
Institute, Rome, Italy.
Speed T. 2003. Statistical Analysis of Gene Expression Microarray Data. Chapman &
Hall/CRC, p. 240.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
3.5 Genų ekspresijos analizė
DNR mikrogardelės:
-principas
-galimybės
-taikymas
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 2
1. Struktūrinė genomika:
Genomo sekvenavimas ir išreikštų
sekų žymenys (EST)
2. Funkcinė genomika:
• Genų pasireiškimo nustatymo būdai:
Mikro-gardelės ir DNR sekų
nuskaitymo profiliavimas
• Įterpimo mutagenezė
• Atskiro nukleotido polimorfizmo
(SNP) žymėjimas genolapyje
• Genolapiu paremtas sugretinimas
(angl. map-based cloning)
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
http://www.genetik.uni-bielefeld.de/MolMyk/treffen/work2/bioinformatikworkshop/
Slide 3
BIO technologijos
(genomika)
NANO technologijos
(mikrogardelių lustai)
INFORMACINĖS
technologijos
Tyrimai mikrogardelių pagalba
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 4
Centrinė molekulinės biologijos dogma
DNR
replikacija
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
RNR
Baltymai
transkripcija
transliacija
(RNR sintezė)
(baltymo sintezė)
Slide 5
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 6
Tradicinė biologija:
Ieško genų, kurie skirtingai pasireiškia
Tiria šių genų funkcijas
Nustato tiriamo geno sąveiką su kitais genais
Tyrimai paremti mikrogardelių principu:
Galima masinė paralelinė genų ekspresijos analizė
Nedidelį genomą galima tirti visą iškart
Nustato ne tik atskirus besiskiriančius genus, bet ir besiskiriančias genų grupes
Analizė parodo santykinio ekspresijos lygio skirtumus
Analizuoti galima ne tik atskirą molekulę, bet ir jų kompleksus
Efektyvi funkcinė genų analizė
Galima identifikuoti reguliacinius ir ląstelių procesus
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 7
DNR mikrogardelės, taip pat vadinama genų lustais (angl. DNA
chips, DNA arrays, DNA microarrays), yra funkcinės genomikos
metodas, skirtas diagnostikai, mutacijų ir polimorfizmo suradimui,
genų paieškai, genų ekspresijai tirti bei genolapių kūrimui. (detalesnė
informacija Gibson 2002)
Jau daugiau nei dešimtmetį (nuo 1995 m.)
gyvuoja DNR mikrogardelių technologija,
kurią naudojant galima vienu metu tirti visų
organizmo koduojamų genų ekspresiją. Tai
vienas iš efektyviausių genomo tyrimo
metodų ir jo atsiradimas buvo sąlygotas
didėjančio sekvenuotų genomų skaičiaus bei
poreikio tirti įvairių organizmų genų
funkcionavimą.
DNR gardelių metodas panaudotas žmogaus
genų ekspresijos sveikuose audiniuose
įvertinimui. Gauti transkripcijos lygio
standartai naudojami patologinių procesų
nustatymui.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 8
DNR mikrogardelių principas
GACTGAACGT
Nežinoma
||||||||||
CTGACTTGCA
T
C
A
G
TAGGC T G
T
Žinoma
T
GC
T
C
TA
ATCCGACAATGACGCC
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
• Vertinimas nežinomos DNR (susintetinta
atvirkštinės transkriptazės pagalba nuo iš
ląstelės išskirtų mRNR) panaudojant
hibridizaciją.
• Žinoma DNR yra taškuojama ant
plokštelės.
• Pažymėta nežinoma DNR suliejama su
žinoma DNR ir vyksta hibridizacija.
• Plokštelė yra nuplaunama ir skenuojama.
http://www.biology.washington.edu/fingerprint/
Slide 9
Suformuotos mikrogardelės talpina
tūkstančius skirtingų DNR
pavyzdžių.
Gardelės gali būti formuojamos ir
tiesiai ant aktyvuoto stiklo paviršiaus
sintetinant oligonukleotidus. Tai
dažniau naudojamas būdas.
Oligonukleotidai (tai paprastai tai 2030 nukleotidų vienguba grandinė)
naudojami komplementarios DNR
segmentų suradimui.
Genų ekspresijos lygis (t.y. žymėtos mRNR kiekis prisijungęs prie
mikrogardelėse esančios DNR) įvertinamas kompiuterinių programų
pagalba, lyginant fluorescencijos signalų raiškumą. Tai kiekybinė
analizė.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
www.bioalgorithms.info
Slide 10
DNR mikrogardelės (taškinės gardelės)
1) Gardelės suformuojamos iš
reikiamų cDNR fragmentų
2) Panaudojamas didelio
tikslumo automatinis
taškavimas
3) cDNR taškuojama ant
mikroskopo stiklo plokštelių
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 11
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 12
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 13
DNR gardelių technologijos
Gardelės
tipas
Taškų tankis
(1 cm2)
Zondas
Mėginys
Žymėjimas
Nailono
makrogardelės
<100
cDNR
RNR
Radioaktyvus
Nailono
mikrogardelės
<5000
cDNR
mRNR
Radioaktyvus/
Fluorescencinis
Stiklo
mikrogardelės
<10000
cDNR
mRNR
Fluorescencinis
Oligonukleotidų
Gardelės
<250000
oligonukleotidai
mRNR
Fluorescencinis
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
www.eng.uiowa.edu/~tscheetz/doc/CLCG/PPT
Slide 14
Kiekvienoje mikrogardelėje
(dydis maždaug 100um) yra
PCR sekvenuotos DNR sekos
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
http://www.bioinfbook.org
Slide 15
ACTGC
ACTGC
ATCCGACAATGACGCC
Visiškas atitikimas
ACTGC
ATCCGACAATGACGCC
Mažesnis atitikimas
ATTCC
ATCCGACAATGACGCC
ACCCC
ATCCGACAATGACGCC
Mažas atitikimas
Hibridizacijos principas yra
panaudojamas genų ir jų ekspresijos
nustatymui, o taip pat DNR sekų
atitikimo palyginimui.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Fluorescenciškai pažymėti mėginiai
hibridizacijos proceso metu jungiasi prie
mikrogardelių DNR
www.bioalgorithms.info
Slide 16
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 17
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
http://www.fao.org/DOCREP/003/X6884E/
Slide 18
Taškinės mikrogardelės metodu (angl. spotted or two-channel microarrays)
negalima nustatyti absoliučios geno veiklos išraiškos
Genas 1
Genas N
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 19
Oligonukleotidų mikrogardelės (angl. oligonucleotide or single-channel
microarrays) metodu (iš dešinės) galima nustatyti absoliučią geno veiklos išraišką
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 20
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 21
Duomenų analizė
1) Atskirų genų analizė
Absoliučios reikšmės gali būti klaidinančios.
Reikalingas atskaitos taškas (kontrolė) tam, kad būtų galima statistiškai
įvertinti atskiro geno ekspresijos patikimumą. Naudojamas
vidurkis/nukrypimas patikimumo įvertinime.
2) Ko-ekspresijos analizė
Panašiai išreikštų (ekspresuotų) genų paieška
eksperimentas 1
Genas i:
eksperimentas 2
eksperimentas 3
(x1,x2,x3,…) Tai šio geno ekspresijos profilis
x1,x2,x3,.. paprastai yra logaritminėje skalėje
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 22
Genų p ekspresijos duomenys mėginiuose n
iRNR mėginiai
mėginys1 mėginys2 mėginys3 mėginys4 mėginys5 …
Genai
1
2
3
4
5
0.46
-0.10
0.15
-0.45
-0.06
0.30
0.49
0.74
-1.03
1.06
0.80
0.24
0.04
-0.79
1.35
1.51
0.06
0.10
-0.56
1.09
0.90
0.46
0.20
-0.32
-1.09
...
...
...
...
...
Geno i ekspresijos lygis iRNR mėginyje j
=
V.Baliuckas
Log( Raudonos sp. intensyvumas / Žalios sp. intensyvumas)
Log(Vidurkis PM - Vidurkis MM)
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 23
Mikrogardelių panaudojimas
Genų ekspresijos analizė:
Ieško genų skirtumų
Tiria atsaką į aplinkos faktorių įtaką
Ligų eigą ir vykstančius procesus
Vaistų poveikį
DNR sekų variacijos nustatymas:
Genetinis charakterizavimas
Somatinių mutacijų aptikimas
Tiesioginis sekvenavimas
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 24
DNR mikrogardelės gali būti naudojamos konkrečiose chromosomų vietose esančių
genomo sekų nuskaitymui ir vertinimui. Atskiro nukleotido polimorfizmo (SNP)
mikrogardelės naudojamos individų ar tarppopuliacinės genetinės variacijos nustatymui.
Trumpų oligonukleotidų gardelės gali būti naudojamos atskiro nukleotido polimorfizmo
identifikavimui, tam kad patikrinti jo įtaką genetinei įvairovei ar genetiškai užkoduotą
polinkį įvairioms ligoms.
Palyginti neseniai pradėtas naudoti DArT (angl. Diversity Array Technology) metodas
genetinio polimorfizmo nustatymui (žr. Jaccoud et al. 2001). Gali būti taikomas grupės ar
pavienių individų tyrimams, atitinkamai formuojant tiriamuosius mėginius.
DArT taikymo procesas susideda iš 4 pagrindinių dalių:
polimorfinės gardelės (angl. diversity panel) formavimas iš genetiškai įvairios grupės
individų genominės DNR
tiriamųjų mėginių formavimas ir jų fluorescencinis ženklinimas (Cy3 ir Cy5)
hibridizacija tiriamųjų mėginių su polimorfine gardele
plokštelių skenavimas ir analizavimas
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 25
Preliminarus žymenų sistemų lyginimas analizuojant manijoko genetinės
įvairovės struktūrą
SSR: 36 SSR žymenys
DArT: gardelė iš ~1000 klonų
•Kodominantiniai žymenys
•Dominantiniai žymenys
•Labai polimorfiniai
• Vidutiniškai polimorfiniai
•Paruošimo kaina
• Paruošimo kaina
~36000 US$ (36 žymenims)
~20000 US$ gardelei (1000
polimorfinių genų klonų)
•Žemas našumas
•Didelis našumas
•Genetinės informacijos kaina
/lokusas /genotipas: 0.5 US$
• Genetinės informacijos kaina
/lokusas /genotipas: 0.025 US$
DArT metodas yra nepriklausomas ar nesiremia informacija apie DNR sekas. Gali
būti taikomas genų bankų kolekcijoms vertinti, nes padengia didelę genomo dalį
(mikrogardelių metodo naudojimas SNP tarp genotipų vertinimui, yra kol kas per
brangus platesniam taikymui).
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
http://www.generationcp.org/vw/Download/ARM_2004/
Slide 26
EST duomenų bazės
Eksperimento
dizainas
Tiriamos medžiagos parinkimas
Mėginių paruošimas
Žiurkė
Mikrogardelės
dizainas
Pelė
Klonų pergrupavimas
Plokštelės
paruošimas
Žmogus
Mikrogardelių
duomenų bazė
Pušis
Hibridizacija
Kompiuterinė analizė
Kitos duomenų bazės
Duomenų
bazė 1
Koordinuota
genų
ekspresija
Duomenų
bazė n
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Ekspresijos
skirtumų
analizė
Statistinė
analizė
Gauto vaizdo
pavertimas
kiekybiniais
duomenimis
Slide 27
Duomenų gavimas eksperimentuose naudojant
mikrogardelių metodus
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 28
MIAME duomenų bazė (minimumas informacijos apie
mikrogardelių eksperimentą)
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 29
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Eichinger 2005
Slide 30
Duomenų normalizavimas
(išsibarstymo sumažinimas ir variacijos
suvienodinimas tarp pakartojimų)
Klasteriavimas
T-testai
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 31
• Kiekvienam genui apskaičiuojama vidutinė išraiška (kontrolinio ir bandomo varianto)
• Nulinė hipotezė: abu variantai nesiskiria
• Slenkstinė t-testo reikšmė paprastai imama p<0.05
• Tinkamą p reikšmę reikia koreguoti, priklausomai nuo tiriamų genų skaičiaus (kuo
didesnis genų skaičius, tuo mažesnė p reikšmė parodo esminius skirtumus)
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 32
Sample 1
Sample 2
Gene 1
1.04
2.08
Gene 2
3.2
10.5
Gene 3
3.34
1.05
Gene 4
1.85
0.09
Kiekybinė analizė
Klasterių sudarymas
(hierarchinis, k-vidurkių)
Prižiūrima, neprižiūrima analizė
(angl. supervised, unsupervised)
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Principinių komponenčių
analizė
Automatinis grupavimas
(angl. self-organising maps)
Slide 33
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Clarke and Zhu (2006)
Slide 34
SAS programa tipinei DNR mikrogardelių analizei:
y ijk a j d i a d ij e ijk
proc mixed data=duomenys;
class dye array;
model signal = dye / outp=rrr;
random array array*dye;
lsmeans dye/ pdiff;
run;
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 35
Mikrogardelių eksperimentų privalumai
Našumas
>20 000 genų per 1-4 savaites
Apimtis
Mielių ar pelės genomas telpa į vieną gardelę
Pritaikomumas
Kuo daugiau genomų sekvenuota, tuo daugiau gardelių gali būti
pagaminta. Atskiram atvejui galima kurti unikalias gardeles.
Praktiškumas
Neribojamas RNR pavyzdžių technologinei įrangai pateikimas
Ekonomiškumas Gardelės suformavimas 20 000 genų kainuoja apie 350$
Mikrogardelių eksperimentų trūkumai
Kaina
Kai kuriais atvejais mokslininkams yra per brangu naudoti reikiamus
kontrolinius variantus ar pakartojimus.
RNR
reikšmingumas
Genų ekspresijos galutinis produktas yra baltymas.
Kokybės kontrolė Neįmanoma atskirus elementus įvertinti ant gardelės paviršiaus.
Įvairūs iškraipymai skenuojant gardelę ar analizuojant duomenis (angl.
artifacts).
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 36
Genomika/proteomika yra labiausiai besivystančios sritys miško biotechnologijoje.
Tikėtina, kad visas genomas ar didžioji dalis išreikštų genų sekų bus artimiausiu metu
gauta, be Populus trichocarpa, dar bent 2 miško medžių rūšims – tai Pinus taeda ir
Eucalyptus globulus. Tada dar labiau suintensyvės funkcinės genomikos vaidmuo
(mikrogardelių taikymas, modelinių medžių rūšių lyginimas su tiriamomis, genetinių
modifikacijų tyrimai). Didelės EST bibliotekos bus naudojamos kandidatinių genų
tyrimuose, ypač padaugėjus modelinių medžių rūšių su pilnais fiziniais ir genetiniais
genolapiais. Lyginamoji genomika ir jos taikymas gali pasiekti ne tik rūšies, genties, bet
net ir šeimos lygį. Kartu su fundamentaliaisiais tyrimais išaugs ir taikomųjų tyrimų
apimtys. Kartu su tradicine medžių selekcija bus taikomi siejamosios (angl. association)
genetikos metodai, identifikuojant norimus genų alelius. Vis daugiau genų bus
identifikuojama genetinių modifikacijų tyrimuose.
Ateityje oligonukleotidų pagrindu sudaromos mikrogardelės, kaip duodančios
patikimesnius rezultatus, matomai keis klonų pagrindu sudaromas, nežiūrint to, kad
pastarosios yra mažiau kainuojančios. Taip pat galima laukti didesnio mikrogardelių
panaudojimo miško medžių selekcijoje.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
www.fao.org/biotech/
Slide 37
Literatūros sąrašas
Baldi P. and Hatfield G.W. 2002. DNA Microarrays and Gene Expression, Cambridge.
Bretz F., Landgrebe J. and Brunner E. 2003. Efficient design and analysis of two color
factorial microarray experiments. Biostatistics.
Clarke J.D. and Zhu T. 2006. Microarray analysis of the transcriptome as a stepping
stone towards understanding biological systems: practical considerations and
perspectives. The Plant Journal 45: 630–650.
Mount D.W. 2004. Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis. 2nd Edition, Cold
Spring Harbor, p. 692.
Gibson G. 2002. Microarrays in ecology and evolution: a preview. Molecular Ecology
11:17–24.
Jaccoud D., Peng K., Feinstein D. and Kilian A. 2001. Diversity arrays: a solid state
technology for sequence information independent genotyping. Nucleic Acids Research
29.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius
Slide 38
FAO. 2004. Preliminary review of biotechnology in forestry, including genetic
modification. Forest Genetic Resources Working Paper FGR/59E. Forest Resources
Development Service, Forest Resources Division. Rome, Italy.
Kohane I.S. et al. 2002. Microarrays for an Integrative Genomics. MIT Press,
Cambridge, MA.
McLachlan G.J., Do K-A., Ambroise C. 2004. Analyzing Microarray Gene Expression
Data. Hoboken, NJ: Wiley.
Spooner D., van Treuren R. and de Vicente M.C. 2005. Molecular markers for genebank
management. IPGRI Technical Bulletin No. 10. International Plant Genetic Resources
Institute, Rome, Italy.
Speed T. 2003. Statistical Analysis of Gene Expression Microarray Data. Chapman &
Hall/CRC, p. 240.
V.Baliuckas
Genetikos ir selekcijos skyrius