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probable et la plus dangereuse. Récemment, l’IRBA a développé un
anticorps anti-ricine neutralisant. Son administration loco-régionale
dans le poumon par voie aérosol apparaît comme la solution la plus
efficace et rapide pour neutraliser la toxine inhalée.
L’objectif de ce projet était de développer, d’une part, une formulation médicamenteuse respectant l’intégrité et l’affinité de
l’anticorps anti-ricine permettant son administration par voie aérosol et d’autre part, la mise au point d’un générateur d’aérosol
permettant l’administration de cet anticorps dans le territoire pulmonaire cible, l’alvéole.
Méthodes.— L’intégrité physique de l’anticorps formulé a été évaluée en termes d’agrégats avant et après nébulisation par DLS,
HPLC-SEC-MALLS et microscopie de fluorescence. L’affinité de
l’anticorps pour sa cible a été mesurée par Biacore.
Les performances du dispositif de nébulisation ont été testées
pour la masse inhalable et la granulométrie selon la pharmacopée
européenne, complétée par des images scintigraphiques de dépôt
pulmonaire chez le macaque.
Résultats.— La formulation de l’anticorps anti-ricine développée a
permis le stockage sous forme lyophilisée à +4 ◦ C, une reconstitution extemporanée et l’aérosolisation tout en respectant l’intégrité
physique et l’affinité de l’anticorps.
Le nébuliseur à tamis vibrant mis au point a permis d’obtenir un
aérosol dont la taille est comprise entre 1 ␮m et 2 ␮m pour atteindre
les alvéoles pulmonaires. Couplé à une chambre d’inhalation spécifique, ce prototype a permis d’obtenir une fraction inhalable
supérieure à 80 % associé à un MMAD d’aérosols inférieur à 2 ␮m avec
un débit de 0,2 mL/min. Les performances du dispositif sont confirmées par le dépôt pulmonaire chez le macaque évalué en moyenne
à 18 %.
Conclusions.— Ce projet a abouti pour la première fois, au développement d’un dispositif prototype nébuliseur-anticorps anti-ricine
permettant, d’assurer le traitement immédiat et automatique d’un
homme suite à une exposition pulmonaire à la ricine.
Résultats.— In vivo, ␣B-crystallin était surexprimée chez les
patients atteints de FPI au niveau des cellules épithéliales hyperplasiques et des myofibroblastes. Chez la souris, après induction de
fibrose (1) le taux de collagène était significativement moins augmenté chez les KO que les WT, (2) le taux de TGF-␤1 dans les LBA
des souris KO était significativement plus faible que chez les souris
WT, (3) l’expression du TGF-␤1, de PAI-1 et du procollagène était
plus faible chez les souris KO.
In vitro, en présence de rTGF-␤1 : (1) ␣B-crystallin était surexprimée précocement et (2) dans les cellules épithéliales et les
fibroblastes primaires de souris KO, la voie du TGF-␤1 était altérée
par rapport aux contrôles avec une baisse de l’expression d’␣SMA, PAI-1, Snai2 et TGF-␤1 ; (3) ␣B-crystallin avait un rôle direct
sur les SMADs, voie de signalisation du TGF-␤1. L’inhibition d’␣Bcrystallin par des SiRNA favorisait la localisation cytoplasmique de
SMAD4 inhibant ainsi la TEM induite par TGF-␤1. À l’inverse, la
surexpression d’␣B-crystallin favorisait la localisation nucléaire de
SMAD4. ␣B-crystallin, en interférant avec la protéine E3-ubiquitin
ligase spécifique de SMAD4, TIF1␥, modulait le taux d’ubiquitination
de SMAD4 et régulait sa localisation.
Conclusion.— ␣B-crystallin contrôle la localisation cellulaire de
SMAD4 en changeant son statut d’ubiquitination par son action sur
TIF1␥. ␣B-crystallin peut ainsi moduler la voie du TGF-␤1 et la TEM
lors de la FPI.
ANR 11-BSV-011-01 meso-IPF/GW et OB ont rec
¸u le soutien du Fond
de Dotation « Recherche en Santé Respiratoire » (FRSR).
http://dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2014.04.054
O. Burgy a , P.-S. Bellaye a , G. Wettstein a , J. Colas a , S. Causse a ,
C. Garrido a , P. Camus a,b , P. Bonniaud a,b,∗
a Inserm U866, France
b Service de pneumologie, CHU, Dijon, France
∗ Auteur correspondant.
Adresse e-mail : [email protected] (P. Bonniaud)
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La petite protéine de choc thermique
␣B-crystallin a un rôle clé dans la
fibrogenèse pulmonaire par son action
sur la SMAD4
P.-S. Bellaye a,∗ , G. Wettstein a , O. Burgy a , V. Besnard c ,
A. Joannes c , J. Colas a , S. Causse a , J. Marchal-Somme c ,
B. Crestani c , C. Garrido a , P. Camus a,b , P. Bonniaud a,b
a Inserm U866, France
b Service de pneumologie, Dijon, France
c Inserm U700, Paris, France
∗ Auteur correspondant.
Adresse e-mail : [email protected] (P.-S. Bellaye)
Mots clés : Infection ; Inflammation
Introduction.— La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une
maladie de pronostic sombre. En présence de TGF-␤, (1) les fibroblastes pulmonaires deviennent myofibroblastes, cellules clefs de
la fibrogénèse et (2) les cellules épithéliales se différencient en
myofibroblastes (transition épithélio-mésenchymateuse - TEM).
␣B-crystallin est une petite protéine de stress exprimée au niveau
pulmonaire. ␣B-crystallin est induite par différents stress et par
le TGF-␤1. Elle a un rôle majeur dans la réorganisation du cytosquelette. Le rôle d’␣B-crystallin dans la fibrogenèse n’a jamais été
étudié.
Méthodes.— A. Analyses histologiques de poumon de patients FPI.
B. In vivo, injection intra-trachéale de bléomycine (0,07 U/souris)
ou d’adénovirus codant pour TGF-␤1 ou IL1␤ à des souris SV129 WT
ou KO pour ␣B-crystallin. In vitro, cellules épithéliales et fibroblastes primaires étaient traitées par rTGF-␤1.
http://dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2014.04.055
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Implication de la plèvre et des cellules
mésothéliales lors de la fibrose
pulmonaire induite par la bléomycine
administrée par voie générale
Mots clés : Infection ; Inflammation
Introduction.— La fibrose pulmonaire (FP) idiopathique débute classiquement dans les régions sous-pleurales. Lors de la fibrogenèse, le
TGF-␤1 induit la transformation des cellules épithéliales alvéolaires
et mésothéliales (Decologne, J Immunol, 2007) en myofibroblastes
par transition épithélio-mésenchymateuse (TEM). La mort cellulaire
des cellules épithéliales alvéolaires a aussi un rôle dans la fibrogenèse. La bléomycine est un anticancéreux dont l’effet secondaire
le plus grave chez l’homme est une FP. Le rôle de la plèvre et des
cellules mésothéliales dans la toxicité pulmonaire de la bléomycine
administrée par voie générale n’est pas connu.
Méthodes.— In vivo, des souris C57BL/6 étaient traitées par injection intraveineuse (IV) de bléomycine (20 mg/kg/2 jours) ou de NaCl
(CT). Les poumons, les liquides de lavage pleural (LLP) étaient
collectés. In vitro, des cellules mésothéliales pleurales humaines
(Met5A) étaient cultivées en présence de bléomycine.
Résultats.— In vivo, l’administration IV de bléomycine induit à 14 et
21 jours une distribution très périphérique de la fibrose avec (1)
un épaississement de la plèvre et des structures alvéolaires souspleurales (H&E), (2) une augmentation du taux de collagène au
niveau pleural (histomorphométrie), (3) une surexpression d’HSP47
(chaperon du collagène). Afin de comprendre l’implication de la
plèvre nous montrons in vitro que le traitement à la bléomycine
induit (1) une diminution de la viabilité des cellules Met5A (doubles
marquages AnnexineV/7-AAD) corrélée avec (2) une augmentation
de l’activité caspase-1 (WB). In vivo, après traitement à la bléomycine, il existe un recrutement de polynucléaires neutrophiles
Recherche en pneumologie
dans les LLP (May-Grünwald Giemsa), un phénomène de mort cellulaire dans certaines zones sous-pleurales (marquage TUNEL) et une
augmentation du taux de TGF-␤1 dans LLP (respectivement ×3 et
×8 comparé au CT, p < 0,05). Nous suspectons également une TEM
des cellules méothéliales en raison de la surexpression d’HSP27
(Wettstein, FASEB 2013) et d’une migration de cellules pleurales
dans les régions sous-pleurales à J10.
Conclusion.— L’administration systémique de bléomycine chez le
rongeur induit une FP marquée de la plèvre et de la région souspleurale comme cela est observé dans la FPI. Nous montrons une
activation de la caspase-1 et de la TEM des cellules mésothéliales
dans l’initiation de cette FP.
ANR 11-BSV-011-01 meso-IPF/GW et OB ont rec
¸u le soutien du Fond
de Dotation « Recherche en Santé Respiratoire ».
http://dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2014.04.056
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Étude de la régulation du canal
chlorure ANO1 par les microARNs chez
les patients atteints de mucoviscidose
F. Sonneville a,∗ , M. Ruffin a , P. Le Rouzic a , S. Blouquit-Laye b ,
L. Guillot a , A. Clement a , H. Corvol a , O. Tabary a
a CDR Saint-Antoine, Paris, France
b UPRES, EA 220, Suresnes, France
∗ Auteur correspondant.
Adresse e-mail : sonneville.fl[email protected] (F. Sonneville)
Mot clé : Physiologie
Introduction.— La déficience de l’activité du canal chlorure CFTR
observée dans la mucoviscidose (CF) est à l’origine de la dégradation
de la fonction respiratoire des patients. Cette atteinte pulmonaire
est la principale cause de morbidité et de mortalité de ces patients.
En 2008, trois groupes ont identifié un nouveau canal chlorure :
le canal ANO1 (TMEM16a), proposé comme cible thérapeutique
potentielle pour restaurer les efflux chlorures au niveau pulmonaire dans la mucoviscidose. Des travaux précédents du laboratoire
ont également montré que l’activité et l’expression d’ANO1 étaient
diminuées dans un contexte CF et que l’origine de cette diminution
reste aujourd’hui inconnue. Une hypothèse serait que les miRNAs,
comme cela a été montré sur d’autres canaux ioniques, pourraient
avoir un rôle majeur dans cette dérégulation.
L’objectif de ce travail est de comprendre l’origine de la diminution
d’expression d’ANO1 dans les cellules CF en étudiant le rôle des
miRNAs.
Méthodes.— Nous avons utilisé des bases de données bioinformatiques afin d’étudier les miRNAs qui pourraient cibler ANO1.
Pour initier ce projet, nous avons évalué les niveaux d’expression
d’un miRNA candidat par RT-qPCR dans des lignées de cellules épithéliales bronchiques et dans des explants pulmonaires humains CF
et non-CF. Afin de valider le lien entre ANO1 et ce miRNA, nous avons
effectué des expériences de fonctionnalité en étudiant la liaison
du miRNA candidat au 3 UTR d’ANO1 en condition de sur- ou sousexpression du miRNA, et en quantifiant l’expression d’ANO1 dans
ces mêmes conditions.
Résultats.— L’étude bio-informatique nous a permis d’identifier différents miRNAs dont miR-9 comme régulateurs potentiels d’ANO1.
L’étude de l’expression de miR-9 dans un contexte CF versus non-CF
n’a cependant pas montré de différence d’expression de celui-ci,
ni de régulation d’ANO1 par celui-ci.
Conclusion.— Nos résultats suggèrent que miR-9, seul, ne régule pas
l’expression d’ANO1 au niveau des cellules épithéliales bronchiques,
mais nous a permis de mettre en place les techniques qui serviront
de base à ce projet. Chez les patients CF, des stratégies thérapeutiques alternatives à la déficience de CFTR sont d’un intérêt
majeur et sont complémentaires aux stratégies protéiques proposées pour CFTR. De plus ces stratégies visant ANO1 pourraient être
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appliquées à un grand nombre de patients en étant indépendantes
de la mutation de CFTR.
http://dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2014.04.057
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Effets du SAHA (iHDAC) sur un modèle
ex vivo d’épithélium nasal de patients
atteints de mucoviscidose
A. Bergougnoux a,b,c,∗ , L. Knabe a , A. Fort a,d , E. Bribes a,c ,
R. Chiron a , A. De Sario b,c , M. Claustres a,b,c , N. Molinari a,c ,
M. Taulan-Cadars a,b,c , I. Vachier a , A. Bourdin a,d
a CHU de Montpellier, Montpellier, France
b Inserm U827, Montpellier, France
c Université Montpellier I, Montpellier, France
d Inserm U1046, Montpellier, France
∗ Auteur correspondant.
Adresse e-mail : [email protected] (A. Bergougnoux)
Mots clés : Mucoviscidose ; Infection-Inflammation
Introduction.— La mucoviscidose résulte d’un défaut d’expression
membranaire de protéine CFTR. Le SAHA, inhibiteur d’Histone
DéACétylases (iHDAC), est capable de restaurer une protéine CFTR
mature et fonctionnelle dans la lignée cellulaire CFBe41o- (F508del
homozygote). Les objectifs de ce travail sont d’obtenir et de caractériser notre modèle ex vivo d’épithélium nasal différencié en
quantifiant l’expression de marqueurs épithéliaux (FOXJ1, MUC5AC,
MUC5B) et inflammatoires (IL-8, ALOX15A, ALOX15B) et d’évaluer
l’action du SAHA sur la restauration de CFTR dans ce modèle ex
vivo.
Méthodes.— À 28 jours de différenciation des epithelia de patients
CF F508del homozygotes (n = 8) ou de témoins sains non-CF (n = 10),
un traitement basolatéral de SAHA (4 ␮M) est appliqué 5 jours (J + 5)
puis arrêté 5 jours (J + 10). L’hyperacétylation des lysines (Western
Blot, WB) et l’absence de surmortalité cellulaire (activité LDH) produite par le SAHA ont été vérifiées. L’expression du CFTR (RTqPCR
et WB), des marqueurs épithéliaux et inflammatoires (RTqPCR), la
sécrétion des mucines (ELLA) et d’IL-8 (Elisa) ont été évaluées avant
et après traitement. Les modifications structurelles de l’épithélium
ont été déterminées par immunofluorescence (marquage MUC5AC,
␤tubuline et DAPI).
Résultats.— En l’absence de traitement, l’expression des marqueurs
épithéliaux varie peu entre CF et non-CF. À J + 5, nous observons
une diminution significative de l’expression de CFTR, ainsi que du
taux de transcrits ALOX15A et ALOX15B. Bien que la synthèse d’IL8 (ARNm) ou sa sécrétion basolatérale ne soient pas modifiées, sa
sécrétion apicale est diminuée. Par ailleurs, nous observons une
diminution significative des transcrits MUC5AC et MUC5B, de la
sécrétion apicale des mucines et du nombre de cellules à mucus.
Nous observons une réversibilité de ces effets à J + 10.
Conclusions.— Le SAHA ne permet pas la restauration apicale du
CFTR dans notre modèle ex vivo d’épithélium respiratoire différencié, contrairement à ce qui a été observé dans la lignée
transformée CFBe41o-. De plus, le SAHA induit une augmentation
de l’inflammation par modification du gradient chimio-attractant
d’IL-8 et diminution de la synthèse de lipoxygénases impliquées
dans la résolution de ce processus. Enfin, le SAHA induit une dédifférenciation transitoire des cellules caliciformes.
http://dx.doi.org/10.1016/j.rmr.2014.04.058
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Les cellules souches
mésenchymateuses réduisent
l’apoptose des cellules épithéliales
alvéolaires induite par l’hypoxie en
modulant la signalisation antioxydante