Transcript Ievads_MolGen_8 - Latvijas universitāte
Ievads
Molekulārajā Ģenētikā
1. DNS un RNS Struktūras 2. Genoms 3. DNS Replikācija
4. DNS Reparācija un Rekombinācija
5. Transkripcija, mRNS nobriešana 6. Translācija 7. Gēnu Ekspresijas Regulācija 8. Metodes, Gēnu Inženierija DNS sintēze (replikācija) DNS RNS sintēze (transkripcija) RNS proteīnu sintēze (translācija) PROTEĪNS aminoskābes
http://priede.bf.lu.lv/ Studiju materiāli / MolekularasBioloģijas / IevadsMolGen / LV
Dažas DNS/RNS analīžu metodikas
• Elektroforēze
– sadala molekulas pēc lādiņa, izmēriem un struktūras
• Hibridizācija
– detektē specifiskas sekvences, pamatojoties uz komplementārām mijiedarbībām
• Gēnu inženierija
(rekombinanto DNS tehnoloģija)
– kombinē DNS no dažādiem avotiem
• Mutaģenēze
– ievieš gēnos interesējošās mutācijas
• PCR
(Polimerāzes ķēdes reakcija)
– pavairo specifiskus DNS fragmentus
• Sekvenēšana
– nosaka DNS fragmentu nukleotīdu secību
ELEKTROFORĒZE sadala DNS molekulas pēc izmēriem bufera šķīdums DNS fragmenti agarozes gēls elektrods elektrods elektrods elektrods mazāki DNS fragmenti pārvietojas ātrāk (tālāk) par lielākiem
Molecular Biology of the Gene, 5th Edition
HIBRIDIZĀCIJA detektē specifiskas DNS vai RNS sekvences Hibridizācijas metodes princips denaturācija zonde hibridizācija hibridizējusies zonde
Life The Science of Biology, 7th Edition
HIBRIDIZĀCIJA detektē specifiskas DNS vai RNS sekvences Hibridizācijas apstākļu ietekme uz rezultātu gēna A zonde; vienpavediena DNS analizējamo DNS maisījums; vienpavediena formā (denaturētas) hibridizācija 50% formamīdā 42 o C temperatūra 35 o C temperatūra nekomplementaritāte tikai A veido stabilu divpavedienu DNS A, C un E veido stabilu divpavedienu DNS
HIBRIDIZĀCIJA detektē specifiskas DNS vai RNS sekvences Gēnu lokalizēšana hromosomās
HIBRIDIZĀCIJA detektē specifiskas DNS vai RNS sekvences Gēnu ekspresijas analīze gēnu-specifisku DNS molekulu kolekcija PCR amplifikācija ‘printēšana’ uz slaida (mikročipa) mRNS no parauga 1 iezīmētas ar sarkanu fluorescentu iezīmi mRNS no parauga 2 iezīmētas ar HIBRIDIZĒ SKALO SKENĒ SARKANOS UN ZAĻOS SIGNĀLUS; APVIENO ATTĒLUS zaļu fluorescentu iezīmi neliels mikročipa rajons, kas satur zondes 110 rauga gēniem
GĒNU INŽENIERIJA kombinē DNS no dažādiem avotiem RESTRIKCIJAS ENDONUKLEĀZES šķeļ specifiskas DNS sekvences ŠĶĒLUMS ŠĶĒLUMS ŠĶĒLUMS ŠĶĒLUMS
GĒNU INŽENIERIJA kombinē DNS no dažādiem avotiem Restrikcijas produktus ar atbilstošiem lipīgiem galiem var viegli savienot galu salipšana (“annealing”)
GĒNU INŽENIERIJA kombinē DNS no dažādiem avotiem VEKTORI nodrošina ģenētiskā materiāla “transportu” Prasības vektoram
Spēja replicēties neatkarīgi no saimnieka
Restriktāžu atpazīšanas vietas “Reportiera” gēns(-i) Relatīvi neliels izmērs pBR322 plazmīda saimnieks: E.coli ampicilīna rezistences gēns (amp r ) replikācijas sākums (ori) tetraciklīna rezistences gēns (tet r )
GĒNU INŽENIERIJA kombinē DNS no dažādiem avotiem DNS fragmenta klonēšana plazmīdas vektorā tetraciklīna rezistences gēns ar rekombinanto plazmīdu transformē
Escherichia coli
EcoRI gali plazmīda DNS ligāze savieno fragmentu ar vektoru transformētās šūnas izsēj barotnē, kas satur tetraciklīnu rekombinanta plazmīda izdzīvo un veido kolonijas tikai tās baktērijas, kuras transformētas ar rekombinanto plazmīdu
Molecular Biology of the Gene, 5th Edition
GĒNU INŽENIERIJA kombinē DNS no dažādiem avotiem Klonētā DNS fragmenta pavairošana baktērijas šūnas (kolonijas), kas satur rekombinanto plazmīdu šūnu kultūra producē simtiem miljonu kopiju pavairota un attīrīta rekombinantā plazmīda modificēts
GĒNU INŽENIERIJA kombinē DNS no dažādiem avotiem EKSPRESIJAS VEKTORI ļauj iegūt lielus daudzumus proteīna ekspresijas vektors promoters ribosomu saistības rajons transkripcijas terminators ekspresējamais gēns (kodējošā sekvence) gēns
Life The Science of Biology, 7th Edition
DNS BIBLIOTĒKAS cilvēka divpavedienu DNS šķeļ ar restrikcijas endonukleāzēm miljoniem DNS fragmentu klonē plazmīdās rekombinantās DNS transformē baktērijas genomiskās DNS bibliotēka
kDNS (kopijas DNS) iegūšana audi (piem., smadzenes) lizē šūnas un attīra mRNS mRNS hibridizē ar poli-T praimeri mRNS ar reverso transkriptāzi iegūst komplementāru DNS kDNS ar RNāzi H degradē RNS ar DNS polimerāzi sintezē otru kDNS ķēdi; RNS fragments darbojas kā praimeris mRNS divpavedienu kDNS kopija
Genomiskās DNS un kDNS bibliotēku atšķirības gēns A gēns B hromosomālā DNS gēns A gēns B eksons introns netranskribējamais DNS rajons ŠĶELŠANA AR RESTRIKCIJAS ENDONUKLEĀZI RNS transkripts DNS fragmenti TRANSKRIPCIJA RNS SPLAISINGS mRNS DNS KLONĒŠANA REVERSĀ TRANSKRIPCIJA UN DNS KLONĒŠANA genomiskās DNS kloni genoma DNS bibliotēkā kDNS kloni kDNS bibliotēkā
Ar MUTAĢENĒZI gēnos ievieš interesējošās mutācijas vektors klonēts normāls gēns pavedienu atdalīšana sintētisks praimeris, kas satur vēlamo mutanto sekvenci DNS sintēze un ligēšana (DNS polimerāze un ligāze) šūnu transformācija, DNS replikācija un šūnu dalīšanās TRANSKRIPCIJA TRANSLĀCIJA normāls proteīns TRANSKRIPCIJA TRANSLĀCIJA proteīns, kas satur vēlamo aminoskābes apmaiņu
TRANSGĒNIE DZĪVNIEKI dod iespēju noskaidrot gēnu funkcijas Dzīvniekos var ieviest dažādas izmaiņas NORMĀLS GĒNS X GĒNA AIZVIETOŠANA GĒNA NOKAUTS GĒNA PIEVIENOŠANA tikai mutantais gēns ir aktīvs nav aktīva gēna aktīvs gan mutantais, gan normālais gēns
TRANSGĒNIE DZĪVNIEKI dod iespēju noskaidrot gēnu funkcijas Transgēno dzīvnieku izveidošana embrionālās cilmes šūnas (EC šūnas) siev.dz. pele DNS fragments ar mutanto gēnu fragmentu ievada šūnās izaudzē kolonijas mutantās EC šūnas injicē agrīnas fāzes embrijā izolē agrīnas fāzes embriju agrīnās fāzes embrijā daļa šūnu ir mutantas atrod (retās) kolonijas, kurās mutantais variants aizstājis normālo gēnu embrionālās cilmes šūnas, kurās viena mērķgēna kopija aizvietota ar mutanto gēnu embriju implantē surogātmātei daļa somatisko šūnu satur mutanto gēna versiju; atrod tādas peles, un izmanto sapārošanai TRANSGĒNĀ PELE SATUR MUTANTO GĒNA KOPIJU DZIMUMŠŪNĀS
TRANSGĒNIE DZĪVNIEKI dod iespēju noskaidrot gēnu funkcijas Transgēna pele (B), kura ekspresē mutantu DNS helikāzi
dNTF (dezoksiribonukleozīdu trifosfāti) bāze praimeris sintezējamā DNS pavediena ‘augošais’ gals matricas DNS pavediens divpavedienu DNS vienpavediena DNS Atgādinājums par to, kā dabā notiek DNS sintēze (replikācija)
Molecular Biology of the Gene, 5th Edition
katalīze praimeris bāzu sapārošana matrica pirofosfatāze
POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA (PCR) amplificē DNS fragmentus divpavedienu DNS karsēšana, lai atdalītu pavedienus (denaturācija) praimeru hibridizācija DNS polimerāze +dATF +dGTF +dCTF +dTTF DNS sintēze no praimeriem 1. solis 2. solis PIRMAIS CIKLS 3. solis DNS denaturē un hibridizē ar praimeriem DNS sintēze DNS denaturē un hibridizē ar praimeriem DNS sintēze DNS denaturē un hibridizē ar praimeriem DNS sintēze amplificējamais divpavedienu DNS rajons DNS oligonukleotīdu praimeri PIRMAIS CIKLS (producē 2 divpavedienu DNS molekulas) OTRAIS CIKLS (producē 4 divpavedienu DNS molekulas) TREŠAIS CIKLS (producē 8 divpavedienu DNS molekulas)
Molecular Biology of the Cell, 4th Edition
PCR pielietojums kriminālistikā – DNS ‘pirkstu nospiedumi’
Molecular Biology of the Cell,4th Edition
DNS SEKVENĒŠANA pēc Sangera metodes 2’- dezoksi ATF 2’, 3’- didezoksi ATF F. Sanger (1975) – didezoksi (ķēdes terminācijas, enzimātiskā) metode praimeris praimeris
Molecular Biology of the Gene, 5th Edition
DNS SEKVENĒŠANA pēc Sangera metodes normālie dezoksiribonukleozīdu trifosfāti dGTF, dATF, dTTF, dCTF neliels daudzums viena terminatora ddATF praimeris sekvenējamais DNS pavediens ddATF inkorporācija bloķē tālāko sintēzi
DNS SEKVENĒŠANA pēc Sangera metodes divpavedienu DNS praimeris vienpavediena DNS dATF, dTTF, dCTF, dGTF pārākums un DNS polimerāze Radioaktīvi iezīmēts praimeris vai kāds no dNTF + ddATF +ddTTF +ddCTF +ddGTF Nukleotīdu sekvenci nolasa tieši no gēla virzienā no apakšas uz augšu:
DNS SEKVENĒŠANA pēc Sangera metodes
DNS SEKVENĒŠANA pēc Sangera metodes fluorescenti iezīmēti ddNTF sekvenēšanas reakcijas kapilārā elektroforēze detektors dators Genomes, 2nd Edition