Transcript Slide 1

BIOTEHNOLOĢIJA III :
REKOMBINANTU
BIOTEHNOLOĢIJA
JAUNĀ
BIOTEHNOLOĢIJA
I. Muižnieks, 2013. g.
SVEŠA PROTEĪNA EKSPRESIJA BAKTĒRIJĀS
1. EKSPRESIJAS REGULĀCIJAS LĪMEŅI
2. TRANSKRIPCIJAS REGULĀCIJA
a. promoters
b. operators
c. aktivatori
d. terminatori
3. DNS SEKVENĒŠANAS PRINCIPI
4. DNS UN PROTEĪNU MIJIEDARBĪBAS PĒTĪŠANA
GĒNU INŽENIERIJA
RESTRIKTĀZES, LIGĀZES, DNS MODIFICĒJOŠIE ENZĪMI
GĒNA EKSPRESIJAS REGULĀCIJAS LĪMEŅI:
1. Transkripcija
2. mRNS stabilitāte
3. Translācija
4. Proteīna funkcionalitāte un stabilitāte
5. Replikona funkcionalitāte un stabilitāte
6. Šūnas kopējie regulācijas tīkli un metabolisma
homeostāze
GĒNS - NUKLEOTĪDU SECĪBA,
KAS KODĒ PROTEĪNA STRUKTŪRU
O P
KODĒJOŠĀ DAĻA
T
GĒNA DARBĪBU REGULĒ:
P - promoters, nukleīnskābes rajons, kurā sākas
gēna informācijas pārrakstīšana par mRNS
O - operators, nukleīnskābes rajons, kas regulē
promotera aktivitāti
T - terminators, nukleīnskābes rajons, kurā tiek
pārtraukta gēna transkripcija
Transkripcija un translācija: prokarioti/ eikarioti
Transkripcijas cikls
Transkripcijas regulācija
Polimerāzes
saistīšanas etapi
Promotera un RNS polimerāzes saisitības
efektivitātes noteikšana
Hinc restrikcijas saita aizsardzība ar RNAPol proteīnu
Promotera spēks – RNS sintēzes efektivitātes
mērīšana
Transkripcijas regulācija
GĒNU EKSPRESIJAS REGULĀCIJA
Transkripcijas regulācija
Operons
Operators
Cistrons
+1
RNA-Pol
piesaiste
SD
DB
Promoters
Promotera sekvences pamatelementi
Transkripcijas regulācija
METODES
mRNS starta punkta kartēšana ar S1 nukleāzi
DNS fragments, kas satur promotera rajonu
Plazmīda ar klonētu promotera rajonu
DNS sekvenēšana ar daļēji specifiskas ķīmiskās degradācijas palīdzību
Walter Gilbert,
1932
Andrejs Mirzabekovs,
1937 -2002
http://nationaldiagnostics.com/article_info.php/articles_
id/20
benzoyl
dimethoxytrityl
3'-O-(N,N-diisopropyl
phosphoramidite)
isobutyr
yl
Frederick Sanger, 1918
www.nwfsc.noaa.gov/.../figur
es/moranfig4.htm
METODES
Manuāla
sekvenēšana
Analīzes metodes
Resekvenēšanas metodes
“Resekvenēšana”, vai genoma sekvenēšana nto reizi,
vai genoma daļas sekvenēšana organismam, kam
viena genoma sekvence jau zināma (vai pat
radniecīgam organismam) ir vieglāka un lētāka nekā
de novo sekvenēšana.
Vairākas firmas piedāvā liela apjoma, ātrdarbīgas
paralēlās resekvenēšanas platformas.
454 Life Sciences
(http://www.454.com/enabling-technology/the-system.asp)
Solexa (Illumina)
(http://www.illumina.com/pages.ilmn?ID=203)
PERSONISKIE GENOMA PROJEKTI
Samuel Levy, et al. (Craig Venter)
The Diploid Genome Sequence of an Individual Human
PLoS BIOLOGY October 2007 | Volume 5 | Issue 2113 10 | e254
David A. Wheeler, et al. (James Watson)
The complete genome of an individual by massively parallel DNA
sequencing
Nature 452, 872-876 (17 April 2008)
Jeffrey M. Kidd, et al.
Mapping and sequencing of structural variation from eight human
genomes
Nature 453, 56-64 (1 May 2008)
Analīzes metodes
Analīzes metodes
Solex – Illumina tehnoloģija
Analīzes metodes
Solex – Illumina tehnoloģija
Analīzes metodes
Solex – Illumina tehnoloģija
Solex – Illumina
JONU PUSVADĪTĀJU SEKVENĒŠANA –ION TORRENT TECHNOLOGIES
January 10, 2012
Life Technologies Benchtop Ion Proton Sequencer will sequence human
genomes in one day for less than $1000 by yearend and Illumina will have a
competing sub-$1000 per human genome sequencer by yearend
The Ion Proton™ Sequencer is ideal for sequencing both exomes — regions
in the DNA that code for protein — and human genomes. The Ion Proton™ I
Chip, ideal for sequencing exomes, will be available mid-2012. The Ion
Proton™ II Chip, ideal for sequencing whole human genomes, will be
available about six months later. In addition, the Ion Proton™ OneTouch™
system automates template prep and a stand-alone Ion Proton™ Torrent
Server
performs
the
primary
and
secondary
data
analysis.
Nanopore DNA sequencing technique promises entire genome
in minutes or your money back
PERSONISKIE GENOMA PROJEKTI
Samuel Levy, et al. (Craig Venter)
The Diploid Genome Sequence of an Individual Human
PLoS BIOLOGY October 2007 | Volume 5 | Issue 2113 10 | e254
David A. Wheeler, et al. (James Watson)
The complete genome of an individual by massively parallel DNA
sequencing
Nature 452, 872-876 (17 April 2008)
Jeffrey M. Kidd, et al.
Mapping and sequencing of structural variation from eight human
genomes
Nature 453, 56-64 (1 May 2008)
October 31, 2012
An integrated map of genetic variation from 1092 human genomes
An Integrated map of genetic variation from 1092 human genomes is
now available from Nature and can be downloaded directly from the
Knome Software Makes
Sense of the Genome
The startup’s software takes
raw genome data and creates
a usable report for doctors.
June 12, 2012
Advances in DNA sequencing technology have sharply reduced
the amount of time and money required to identify all three
billion base pairs of DNA in a person’s genome. But the use of
genomic information for medical decisions is still limited because
the process creates such large volumes of data. Less than five
years ago, Knome, based in Cambridge, Massachusetts, made
headlines by offering what seemed then like a low price—
$350,000—for a genome sequencing and profiling package. The
same service now costs just a few thousand dollars.
Transkripcijas regulācija
Operators
lacZ – b galaktozidāze
lacY – laktozes permeāze
lacA – laktozes transacetilāze
CH 2OH
CH 2OH
O
HO
H
OH
H
H
OH
O
H
H
O
OH
H
H
OH
H
OH
laktoze
1, 4-O-b-D-galaktopiranozil-a-D-glikopiranozīds
Negatīvā kontrole ar iespējamu indukciju
Represors / induktors
Izopropil-β-D-tio-galaktozīds (IPTG)
lac operona induktors
Ortofenil-β-D-galaktozīds
lac operona hromogēnais substrāts
5-bromo-4-hloro-3-indolil-β-D-galaktozīds (X-gal)
lac operona hromogēnais substrāts
Operators
Triptofāns
Indolilakrilskābe
Negatīvā kontrole ar iespējamu represiju
Aporepresors / korepresors
Operators
Pozitīvā kontrole ar represiju
Aktivators / inhibītors
Operators
Pozitīvā kontrole ar indukciju
Apoaktivators / Koaktivators
Transkripcijas regulācija:
UP (proteīna neatkarīgie) - elementi
5’ virzienā
no
-35 AGAAAATTATTTTAAATTTCCT
lokalizēta
AGAAAATTATTTTCGAAAAATA
A un T
(NNAAAWWTWTTTTNNAAAARNR)c
bagāta
sekvence
UP, rrnB P1
UPconsensus
Transkripcijas regulācija: CAP aktivācija
CAP- proteīna saistīšanās konsensus: TGTGA --- N6 --- TCACA
Transkripcijas regulācija: enhanseri (pastiprinātāji)
Transkripcijas regulācija:
atenuācija, trp-operons
H-t-H motīvs operatoru – regulācijas proteīnu mijiedarbībā
DNS cilpu veidošana operatoru – regulācijas proteīnu mijiedarbībā
rafA gēna promotera sekvence
Ar proteīnu sastīta DNS fragmenta migrācijas aizkavēšana
elektroforēzē, EMSA
Ar proteīnu sastīta DNS fragmenta migrācijas aizkavēšana
elektroforēzē, EMSA
DNS aizsardzība pret (DNāzes) degradāciju: “footprinting”
rafA promotera fragmenta fūtprints ar
norādītajiem proteīniem.
Vai var atrast represora un CAP proteīna
saistīšanās vietas, noteikt to sekvences ?
Transkripcijas regulācija: biotehnoloģijā
izmantojamās promotera-operatora sistēmas
lac, tac vai trc (-35 trpE, -10 lac) ar IPTG indukciju vai
termolabila LacI klātbūtnē, stiprākai regulēšanai - vairāk LacI;
T7 vēlīnā promotera sistēma,
pārliecīga aktivitāte, toksiskums, proteīnu agregācija;
cold-shock-proteinu gēnu CspA promoteri. 10oC, lai izvairītos
no agregācijas;
lPL arī aukstuma inducējams;
phoA, trpE promoteri - inducējami ar barības vielām
vai to trūkumu.
mRNS 5’ netranslētajā galā esošās secības, kas
nepieciešamas ribosomu saistīšanai
SD sequence consensus: GGAGG located 7 ± 2 nucleotides
upstream from the initiation codon undergo base-pairing to the 3'
of the 16S rRNA of the 30S ribosomal subunit.
Ribosomal protein S1 interacts with a pyrimidine-rich region 5' to
the SD region on mRNAs.
A region named the downstream box (DB), downstream from the
initiation codon of several mRNAs was found to show
complementarity to bases 1469 to 1483 within the 16S rRNA.
Merylin Kozak, eikariotu mRNS
Transkripcijas regulācija
Terminācija:
r - atkarīgā
r - neatkarīgā
Transkripcijas regulācija
r – neatkarīgā
transkripcijas
terminācija
Transkripcijas regulācija
r – neatkarīgās transkripcijas
terminācijas sekvences