Transcript Document 7724040

TRANSGĒNU DZĪVNIEKU
IEGŪŠANA UN IZMANTOŠANA
BIOTEHNOLOĢIJĀ
Transgēni, cilmes šūnas, nokauti un
kloni
JAUTĀJUMI
1. Agrīnā embrioģenēze un cilmes
šūnas
2. Vienkāršie transgēni
3. Gēnu nokauti
4. Dzīvnieku kloni
5. Pieaugušās cilmes šūnas un audu
inženierija
Transgēnu dzīvnieku iegūšana
Transgēnie dzīvnieki tiek iegūti, izmantojot trīs
metodes:
1. Gēnu mikroinjekcija apaugļotas olšūnas
pronukleusā,
2. embrionālo cilmes šūnu injekcija blastocistā,
3. apstrāde ar retrovīrusiem.
http://www.ag.uiuc.edu/~vista/html_pubs/irspsm91/transfor.html
Transgēnu dzīvnieku iegūšana
Transgēnu dzīvnieku iegūšana
Pirmo metodi plaši izmanto transgēnu peļu
iegūšanai. Pēc mikroinjekcijas no peles izņem
nesen apaugļotus vienšūnas embrijus. šim
nolūkam izmanto mikromanipulatorus un īpaši
aprīkotu mikroskopu. Ar speciālu pipeti un
vakuma palīdzību embriju fiksē, un tās
pronukleusā ar kapilāru adatu ievada klonējamo
DNS. Pēc tam embrijus pārnes aizvietotājmātēs,
kuras tos iznēsā. 1 – 4 % no injicētajiem
embrijiem dod transgēnus pēcnācējus.
Zigotas veidošanās
Olšūnas ietver
apvalki:
vitelīna
membrāna
(zona pellucida
zīdītājdzīvniekiem) un
folikulāro šūnu
slānis (corona
radiata
zīdītājdzīvniekiem).
bartleby.com/ 107/5.html
Agrīnā embrioģenēze
Agrīnā embrioģenēze
Oocīts > Zigota > Blastomers/Pāršūnu stadijas >
Morula > Blastocists > Gastrula > Embrijs
Transgēnu dzīvnieku iegūšana
Transgēnu dzīvnieku iegūšana
Otrā metode. No blastocista (dažas dienas pēc
apaugļošanas) iegūst embrionālās cilmes (EC)
šūnas. Tās var audzēt neierobežoti ilgi laboratorijā
un tās nezaudē spēju augt un diferencēties par
jebkuru dzīvnieka audu tipu, veidot veselu jaunu
dzīvnieku. EC šūnas in vitro transformē ar
svešajiem gēniem un ar mikroinjekciju ievada citā
blastocistā. Aizstājējmātes iznēsā dzīvniekus, kurus
veido divu dažādu tpu šūnas, transgēnās un
parastās. Ja transgēnās EC šūnas ir veidojušas
dzīvnieku spermatozoīdu vai olšūnu priekštečus –
šadu dzīvnieku pēcteči visi būs transgēni.
Cilmes šūnas
Cilmes šūnas ir relatīvi vienkāršas šūnas,
kuras spēj ātri augt, neierobežoti ilgi
dalīties šūnu kultūrā un diferencēties par
specializētām šūnām.
Izšķir:
embrionālās cilmes šūnas
pieaugušās (somātiskās) cilmes
šūnas
Cilmes šūnu diferencēšanās potenciāls:
totipotentas (zigota);
pluripotentas; (embrionālās);
multipotentas (pieaugušās).
Embrionālās cilmes šūnas
Priekšrocības:
vieglāk izmantot;
neierobežoti ilgi aug
kultūrā; nerada
imūno atbildi.
Trūkumi:
teratomas (?);
ētiskas problēmas.
EC ŠŪNAS
EC ŠŪNAS
Transgēnu dzīvnieku iegūšana
ES ŠŪNAS
Trešā metode – ar retrovīrusu palīdzību
Vienkāršie transgēni
Nejauša integrācija
Tandemu un polimeru veidošanās
Regulēšanas problēmas
Apklusināšana / delēcijas / metilēšana
Vienkāršie transgēni
Transgēnu identificēšana un
integrācijas vietas lokalizēšana:
fenotips
Southern analīze
PCR
FISH
Vienkāršie transgēni
Pārnesto gēnu regulēšanas problēmas:
inducējami promoteri
enhanseru lokalizācija
izolatoru -MAR domēnu loma
lokusa (pozīcijas) efekts
lokalizācijas sekvences
Transgēna ekspresiju kavē:
(1) cDNS, nevis hromosomālās DNS klonēšana;
(2) integrācija lielā kopiju skaitā;
(3) bagātas sekvences (dzīvniekiem
neraksturīgas);
(4) integrācija vāji ekspresējamā rajonā“pozīcijas efekts”.
Vienkāršie transgēni
Pārnesto gēnu apklusināšana:
delēcijas (Southern analīze)
metilēšana
5-meC atlikums 5’-CCGG-3’ secībās, pierādīšana ar
genoma un ķīmisko sekvenēšanu (DMS un tiosulfāta
apstrādes jūtība)
Izolatori = LCR secības (locus control regions)
Gēnu grupas tiek nodalītas no pārējās hromosomas ar
specifiskām izolatoru DNS secībām.
Izolatorus veido vairāki elementi:
a) sailenseri, kas bloķē integrētā transgēna tuvumā esošo
enhanseru darbību;
b) hromatīna atšķetinātāji, kas inducē histonu deacetilēšanu,
ko pavada lokāla histonu un DNS demitelēšana;
c) AT- bagāti matriksa saistības rajoni (MAR, matrix-attached
regions).
Pārnesto gēnu regulēšanas problēmas:
TRANSGĒNIE DZĪVNIEKI
Nozīmīgākie procesi:
attīstības bioloģija;
no farming uz pharming ;
klonēšana;
akvakultūra;
Izmantojamie organismi un produkti:
visbiežāk zivis;
govis un jaunus proteīna veidus saturošs piens;
perspektīvā: dzīvnieki ar iznīcinātu prionu proteīnu
gēnu.
Mērķi: ražošanas efektivitāte; funkcionāla
(terapeitiska) pārtika, pārtikas drošība.
“FARMING” VIETĀ “PHARMING”
Perspektīvie
preparāti
AAT
Pielietojums
tPA
Faktors VIII
Hemoglobīns
Laktoferīns
CFTR
Cilvēka C
proteīns
Alfa-1-antitripsīns,
iedzimts
deficīts
izraisa
emfizēmu.
Audu plazminogēna aktivators, asins sarecēšanas
kontrole.
Asins recēšanas faktors, hemofīlijas ārstēšana.
Asins olbaltumviela asins pārliešanas preparātos.
Bērnu barības piedeva.
Cistiskās fibrozes transmembrānu vadītspējas
regulators, CF ārstēšana.
Antikoagulants, trombu šķīdināšna.
http://www.nal.usda.gov/bic/Education_res/iastate.info/bio10.html
“FARMING” VIETĀ “PHARMING”
Preparāts
AAT
tPA
Faktors VIII
Faktors IX
Hemoglobīns
Laktoferīns
CFTR
Cilvēka C
proteīns
Dzīvnieks
aita
kaza
aita
aita
cūka
govs
aita
cūka
Peļņa/Dzīvnieks/
gadā (USD)
15,000
75,000
37,000
20,000
3,000
20,000
75,000
1,000,000
GM DZĪVNIEKU PIENĀ SINTEZĒTIE PROTEĪNI
Grūtniecības laiks, mēneši
Dzimumbrieduma sasniegšanas laiks, mēneši
Laiks no transgēna indukcijas līdz pirmajai
dabiskajai laktācijai, mēneši
Pēcnācēju skaits
Piena produkcija, kg/gadā
Neattīrīts rekombinantais proteīns, kg/mātīte
x gads
Vidēji no 2 - 3 laktācijām gadā
Vidēji no 2 laktācijām gadā
Trusis
1
5
Cūka
4
6
Aita
5
8
Kaza
5
8
Govs
9
15
7
16
18
18
33
8
10
1–2
500
1–2
800
1
8000
2,50
4,00
40,00
a
4–5
0,02
b
300
1,50
PEĻU SLAUKŠANA
Pelēm intraperitoneāli injicē oksitocīnu (līdz 5 IU). Pēc tam,
ar precīzi regulējama vakuma pievadīšanu piena dziedzeriem,
iespējams iegūt līdz 1 ml piena. Izmantojot līdzīgu metodi, no
trušu mātēm laktācijas periodā iespējams iegūt līdz 100 ml
piena dienā.
Līdzīgus daudzumus piena iespējams iegūt arī no izolētiem
piena dziedzeriem.
PIRMAIS TRANSGĒNAIS DZĪVNIEKS
Cūkas, kas siekalās ekspresē baktēriju enzīmu
fitāzi izdala vidē ap 75% mazāk fosfātu nekā
parastās cūku šķirnes, tādejādi ievērojami
samazinot lopkopības radīto piesārņojumu.
Golovan SP, Meidinger RG, Ajakaiye A, Cottrill M, Wiederkehr MZ, Barney
DJ, Plante C, Pollard JW, Fan MZ, Hayes MA, Laursen J, Hjorth JP,
Hacker RR, Phillips JP, Forsberg CW.
Pigs expressing salivary phytase produce low phosphorus manure.
Nat Biotechnol 2001, 19: 741–745.
Fitāts – inozitolheksafosfāts;
Viena no galvenajām fosfora
uzkrāšanas formām augos,
īpaši kviešos. Stiprs helatējošs
savienojums, saista divalentos
katjonus, piem., Ca2+.
Tiek noārdīts atgremotāj dzīvnieku kuņģī, citu
dzīvnieku gremošanas traktā – nē. Baktērijas,
noārdot fitātu fermu atkritumos, piesārņo
notekūdeņus ar fosforu.
Cūkas, kas ekspresē spinātu enzīmu desaturāzi
uzkrāj vairāk nepiesātinātu taukskābju, tādejādi
paaugstinot gaļas kvalitāti.
Saeki K, Matsumoto K, Kinoshita M, Suzuki I, Tasaka Y, Kano K, Taguchi Y,
Mikami K, Hirabayashi M, Kashiwazaki N, Hosoi Y, Murata N, Iritani A.
Functional expression of a Delta12 fatty acid desaturase gene from
spinach in transgenic pigs.
Proc Natl Acad Sci USA 2004, 101: 6361–6366.
Paredzams, ka kazas un govis, kas pienā ekspresēs
tādus baktērijas nonāvējošus proteīnus kā cilvēka
lizocīmu, laktoferīnu un lizostafīnu būs mazāk
jūtīgas pret mastītu. To piens būs izturīgāks pret
bojāšanos baktēriju iedarbībā un to varēs lietot
cilvēki, kas slimo ar bakteriālām infekcijām.
Kerr DE, Plaut K, Bramley AJ, Williamson CM, Lax AJ, Moore K, Wells KD,
Wall RJ.
Lysostaphin expression in mammary glands confers protection against
staphylococcal infection in transgenic mice.
Nat Biotechnol 2001, 19: 66–70.
Murray J, Reh W, Anderson G, Maga E.
Changing the composition of milk to improve human health. In: Transgenic
Animal Research, Conference IV, Tahoe City California, 2003, p 32.
Transgēnas vistas
Vistas aug ātrāk nekā aitas un tās var turēt lielā skaitā
salīdzinoši mazās platībās. Vistas olas baltums satur
vairākus gramus proteīna. Līdz šim izmantotas divas
metodes, lai iegūtu vistas, kas nes un ekspresē svešus
gēnus.
1 ) Embrijus inficē ar vīrusa nesēju, kas satur terapijā
izmantojama cilvēka proteīna gēnu un vistas gēna (piem.,
lizocīma) promotera secības, kas nodrošina proteīna
uzkrāšanu olas baltumā.
2) Ar cilvēka gēnu un atbilstošiem promoteriem
transformē gaiļu spermatozoīdus.
Orientējoši dati rāda, ka vistas var producēt līdz 0,1
gramam cilvēka proteīna katrā izdētajā olā
TRANSGĒNI DZIVNIEKI PĀRTIKAI UN SKAISTUMAM
Ātri augošs, lēts, “barojošs
un videi draudzīgs”
"AquAdvantage" lasis
Aqua Bounty Technologies, Bostonas priekšpilsēta,
2003. g. oktobrī pieprasījums FDA;
In September 2010, an FDA advisory panel indicated that the fish is "highly
unlikely to cause any significant effects on the environment" and that it is
"as safe as food from conventional Atlantic salmon"
TRANSGĒNI DZIVNIEKI PĀRTIKAI UN SKAISTUMAM
Sārti fluorescējošas zebru zivtiņas: ir vai nav pārtika ?
TRANSGĒNI DZIVNIEKI PĀRTIKAI UN SKAISTUMAM
GĒNU NOKAUTI
Gēnu nokauts – organisma modifikācija, kas ar
mērķētu delēciju vai inserciju palīdzību
inaktivē specifisku gēnu.
Gēnu nok-ins – organisma modifikācija, kas ar
mērķētu inserciju novieto funkcionējošu gēnu
lokusā, kur atrodas tā paša gēna
nefunkcionējoša kopija.
NOKAUTI
NOKAUTI
NOKAUTI
CRE - LOX SISTĒMA NOKAUTOS
CRE - LOX SISTĒMA NOKAUTOS
CRE - LOX SISTĒMA NOKAUTOS
ESTROGĒNUINDUCĒJAMI
NOKAUTI
TETINDUCĒJAMI
NOKAUTI
ĢENĒTISKAIS FONS UN NOKAUTU FENOTIPS
KLONĒŠANA
Organismu vai šūnu kopiju savairošana veģetatīvā
(bezdzimuma) ceļā
Reproduktīvā klonēšana
Reproduktīvās klonēšanas mērķis ir radīt
dzīvnieku, kuram ir tāda pati DNS kā kādam citam
dzīvniekam. To panāk pārnesot somātiskās šūnas
kodolu uz olšūnu, kuras pašas kodols ir iznīcināts.
Terapeitiskā klonēšana
Terapeitiskās klonēšanas mērķis ir radīt slimas
personas audu vai orgānu veselu kopiju
transplantācijas nolūkam.
KLONĒŠANA
Koloniju veido 108 - 109 šūnu
KLONĒŠANA
DZĪVNIEKU KLONĒŠANA
DZĪVNIEKU KLONĒŠANA
1997. gada 27.
februārī “Nature”
publicē rakstu par
Dolliju – Finn Dorset
šķirnes aitu, kas
iegūta, sapludinot 6
gadus vecas aitas
tesmeņa šūnas ar
bezkodola Skotu
melngalvainās aitas
oocītu.
DZĪVNIEKU KLONĒŠANA
Dollijas klonēšanu
firmas PPL
Therapeutics Roslin
laboratorijās vadīja
skotu zinātnieks Jans
Vilmuts (Ian Wilmut)
Ian Wilmut un Keith Campbell ar līdzstrādniekiem Roslin
Institūtā un Edinburgas biotehnoloģijas firmā PPL
therapeutics izmantoja modificētu kodola pārneses
metodi, iegūstot dzīvotspējīgu aitu no kodola materiāla,
kas bija ņemts no 6 gadus vecas grūsnas aitas tesmeņa
šūnas. Olšūnas ar nomainītiem kodoliem uzsāka dalīties
un veidoja 29 daudzšūnu embrijus, kurus pārnesa 13
aizvietotājmātēs. Pēc 148 dienām piedzima viena aita,
kuru Roslina institūta darbinieki nosauca par Dolliju –
par godu savai iemīļotajai kantrī dziedātājai Dolly
Parton.
http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc471/pages/Lecture20/Lecture20-text.pdf
DZĪVNIEKU KLONĒŠANA
DZĪVNIEKU KLONĒŠANA
OLŠŪNAS KODOLA AIZVĀKŠANA
DZĪVNIEKU KLONĒŠANA
Dollija ar tēvu un bērniem
DZĪVNIEKU KLONĒŠANA
1997. gada
7. augustā
tika ziņots
par pirmā
no
embrionāliem
fibroblastiem klonēta
Holšteinas
šķirnes teļa
iegūšanu.
Teļš vārdā “Gēns” tika klonēts firmas Animal Breeding
Systems Global laboratorijās Viskonsinā, ASV
DZĪVNIEKU KLONĒŠANA
AP, 24.01.2000, No aizmugurē stāvošā buļla
auss klonētie teļi, Japāna
DZĪVNIEKU KLONĒŠANA
AP, 02.05.2000, Advanced Cell Technologies,
Austrālija
KLONĒŠANAS ZOOTEHNIKA :
Dzīvnieku iegūšanas efektivitāte
KLONĒŠANAS ZOOTEHNIKA :
Dzīvnieku iegūšanas efektivitāte
KLONĒŠANAS ZOOTEHNIKA :
Dzīvnieku iegūšanas efektivitāte
KLONĒŠANAS ZOOTEHNIKA :
Dzīvnieku iegūšanas efektivitāte
TERAPEITISKĀ KLONĒŠANA,
IZMANTOJOT PIEAUGUŠĀS
(SOMĀTISKĀS) CILMES ŠŪNAS
UN AUDU INŽENIERIJU
Pieaugušās
(somātiskās)
cilmes šūnas:
izplatītākais
avots – kaula
smadzenes
(bet arī āda,
zarnu epitēlijs,
zobu pulpa,
aknas utt.)
Par pieaugušu cilmes šūnu avotu var kalpot arī citi
audi un orgāni, piem., āda
Dr. J.Ancāns, LU BF;
oriģināla ādas cilmes šūnu izdalīšanas metode
Audu inženierija
apvieno terapeitisko klonēšanu un
bioinženieriju, lai radītu bioloģiskas
aizstājējstruktūras, kuras atjaunotu,
saglabātu vai uzlabotu audu funkcijas.
www.innovitaresearch.org/ news/03122401.ht
Audu
inženierija –
varianti.
In vitro
Audu
inženierija –
varianti.
In vivo
Audu inženierija - shēma
Audu inženierija – piemēri
Audu inženierija – piemēri
Audu inženierija – piemēri
Audu inženierija – piemēri
Audu inženierija – piemēri
Experimental conversion of liver to pancreas.
Horb ME, Shen CN, Tosh D, Slack JM.
Curr Biol. 2003 Jan 21;13(2):105-15.
We show that a modified form of Pdx1, carrying
the VP16 transcriptional activation domain, can
cause conversion of liver to pancreas, both in
vivo and in vitro.
LU Biotehnoloģijas
inovāciju centrs,
Kleisti
Divu ēku rekonstrukcija ar
“Phare” projekta atbalstu
terapeitiskās klonēšanas un
audu inženierijas pētījumu
vajadzībām
P.Stradiņa KUS – šūnu transplantācijas laboratorija,
VM atbalstīts projekts