Transcript Ievads_MolGen_3-DNS replikacija

Ievads
Molekulārajā Ģenētikā
DNS sintēze
(replikācija)
DNS
1. DNS un RNS Struktūras
2. Genoms
3. DNS Replikācija
RNS sintēze
(transkripcija)
4. DNS Reparācija un Rekombinācija
RNS
5. Transkripcija, mRNS nobriešana
6. Translācija
7. Gēnu Ekspresijas Regulācija
proteīnu sintēze
(translācija)
PROTEĪNS
8. Metodes, Gēnu Inženierija
aminoskābes
http://priede.bf.lu.lv/ Studiju materiāli / MolekularasBioloģijas / IevadsMolGen / LV
DNS replikācija
vecā
vecā jaunā
vecā
jaunā
vecā
Molecular Biology of the Gene, 5th Edition
Kaut arī principiāli vienkārša, DNS replikācija ir komplekss process, kurā piedalās daudzi proteīni
vadošā pavediena
matrica
jaunsintezētais pavediens
DNS polimerāze uz vadošā pavediena
praimāze
replicējamā DNS
vienpavediena DNS
saistošie proteīni
DNS helikāze
atpaliekošā pavediena
matrica
RNS praimeris
jaunais
Okazaki fragments
Bakteriofāga T4
replikācijas komplekss
jaunsintezētais
vadošais pavediens
skavas uzlicējs
jaunsintezētais
pavediens
DNS polimerāze uz atpaliekošā pavediena
(nupat pabeigusi Okazaki fragmenta sintēzi)
jaunsintezētais
atpaliekošais
pavediens
replicējamā
DNS
DNS sintēze ir vienpavediena matricas komplementāra kopēšana
matricas DNS pavediens
jaunā pavediena polimerizācija
nukleotīdi
DNS polimerāze nevar uzsākt sintēzi ‘tukšā’ vietā - tai vajadzīgs praimeris ar brīvu 3’ OH grupu
dNTF (dezoksiribonukleozīdu trifosfāti)
praimeris
bāze
matricas DNS pavediens
divpavedienu
DNS
Molecular Biology of the Gene, 5th Edition
sintezējamā DNS pavediena ‘augošais’ gals
vienpavediena DNS
Jaunais DNS pavediens vienmēr tiek sintezēts 5’
3’ virzienā
katalīze
praimeris
bāzu sapārošana
matrica
pirofosfatāze
Molecular Biology of the Gene, 5th Edition
DNS polimerāzes struktūra un darbība
“pirksti”
“īkšķiš”
dNTF
matricas
pavediens
“delna”
dNTF
pozicionēšana
praimera (sintezējamais)
pavediens
nukleotīda
pievienošana
un DNS pārvietošana
DNS polimerāze “atpazīst” pareizo nukleotīdu pēc tā,
vai veidojas bāžu pāris ar matricas pavediena nukleotīdu
bāžu pāris veidojas
bāžu pāris neveidojas
matrica
bāžu pāra
nav
dNTF
dNTF
praimeris
Molecular Biology of the Gene, 5th Edition
Tomēr kļūdas reizēm (~1 / 105) tiek pieļautas
(ja ienākušais nukleotīds ir retā tautomērā formā)
H-saites donors
H-saites akceptors
Molecular Biology of the Gene, 5th Edition
Pati DNS polimerāze 99% no kļūdām arī izlabo: EKSONUKLEOLĪTISKĀ KOREKTŪRA
matricas
pavediens
sintezējamais
pavediens
POLIMERIZĒŠANA
REDIĢĒŠANA
Pati DNS polimerāze 99% no kļūdām arī izlabo: EKSONUKLEOLĪTISKĀ KOREKTŪRA
praimera nesapārotais 3’-gals
bloķē tālāku praimera
pavediena polimerizāciju
praimera
pavediens
matricas
pavediens
retā tautomērā C (C*) forma izveido
bāžu pāri ar A un DNS polimerāze
pievieno to praimera pavedienam
DNS polimerāzes 3’- 5’
eksonukleāzes aktivitāte
nošķeļ nesapāroto nukleotīdu
ātra C* atgriešanās normālajā
citozīna formā (C) izjauc
bāžu pāri ar A
DNS polimerāze
turpina DNS sintēzi
DNS replikācija ir PUSKONSERVATĪVA
matricas pavediens
jaunais pavediens
jaunais pavediens
replicējamā DNS
matricas pavediens
Teorētiski varētu būt arī citi replikācijas mehānismi
Puskonservatīva replikācija
Konservatīva replikācija
Dispersīva jeb sadales replikācija
Life The Science of Biology, 7th Edition
Šis eksperiments (Meselson un Stahl, 1958) pierādīja, ka DNS replikācija ir puskonservatīva
Audzē baktērijas vidē ar
smago slāpekļa izotopu
Pirms baktērijas pārsēj vidē ar vieglo
slāpekļa izotopu (0 minūtes)
visa DNS ir ‘smaga’
Daļu no baktērijām pārsēj
vidē ar vieglo N izotopu;
turpina kultivēšanu
paraugs
pēc 20 min
paraugs
pēc 0 min
paraugs
pēc 40 min
20 minūtēm
(1 replikācijas cikls)
un 40 minūtēm
(2 replikācijas cikli)
(vieglā) DNS
(vidēji smagā) DNS
(smagā) DNS
vecāku DNS
(visa smaga)
Pēc 2 paaudzēm puse no DNS
bija vidēji smaga, puse–viegla;
smagās DNS atlicis vairs nebija
Ievāc paraugus pēc
0 minūtēm,
pirmās paaudzes DNS
(visa vidēja smaga)
vecais
pavediens
jaunā
ķēde
otrās paaudzes DNS
(puse vidēji smaga,
puse viegla)
Abu pavedienu kopēšana notiek vienlaicīgi
REPLIKĀCIJAS DAKŠAS MODELIS
Replicētās DNS
Replicējamā DNS
Replikācijas dakša
Lewin, Genes
Ar vienkāršāko iespējamo mehānismu ir problēma
pavediena sintēze
virziens
kopējais replikācijas
virziens
cukurs
pavediena sintēze
virziens
bāze
trifosfāts
Replikācijas dakša ir ASIMETRISKA:
viens pavediens (vadošais) tiek sintezēts nepārtraukti, bet otrs (atpaliekošais) - kā fragmenti
vadošais pavediens
nupat sintezētā
DNS
atpaliekošais pavediens
ar Okazaki fragmentiem
Katru pavedienu sintezē atsevišķa DNS polimerāze
vadošā pavediena
sintēzes virziens
vadošais pavediens
kopējais DNS
replikācijas virziens
RNS praimeri
DNS polimerāzes
Okazaki fragmenti
atpaliekošais pavediens
atpaliekošā pavediena
sintēzes virziens
replicētā DNS
nereplicētā DNS
Molecular Biology of the Gene, 5th Edition
DNS polimerāzei nepieciešams praimeris;
praimeri (RNS!) uzsintezē praimāze
RNS praimeris
praimāze
Atpaliekošais pavediens tiek sintezēts kā fragmenti,
kuri; pēc RNS praimera degradācijas; tiek savienoti
RNS
praimeris
atpaliekošā
pavediena
matrica
praimāze uzsintezē jaunu
RNS praimeri
DNS polimerāze sāk Okazaki fragmenta
sintēzi no RNS praimera
DNS polimerāze pabeidz
DNS fragmenta sintēzi
RNS praimeris tiek ‘nodzēsts’
(RNāze H un 5’ eksonukleāze)
un aizstāts ar DNS (DNS polimerāze)
DNS ligāze ‘aižšuj’ pārtraukumu,
savienojot Okazaki fragmentus
DNS ligāze savieno fragmentus, izmantojot ATF
izmanto ATF
atbrīvo AMF
DNS polimerāzei nepieciešama vienpavediena matrica:
DNS helikāze atvij replicējamās DNS dubultspirāli
ATF
ADF
Molecular Biology of the Gene, 6th Edition
DNS polimerāzei nepieciešama vienpavediena matrica:
vienpavediena DNS saistošie proteīni stabilizē to
DNS polimerāze
matricas vienpavediena DNS
var veidot īsus bāžu pāru
rajonus (‘matadatas’ struktūras)
vienpavediena DNS
saistošie proteīni
proteīnu kooperatīva saistīšanās iztaisno DNS pavedienu
Savērpšanās problēma
Principles of Biochemistry, 3rd Edition
Superspirāles vijumus atslābina topoizomerāzes
replikācijas komplekss
replikācija
(pozitīvas superspirāles vijums)
topoizomerāze II
DNS pāršķelšana
pārvieto DNS
caur šķēlumu
(negatīvas superspirāles vijums)
Molecular Biology of the Gene, 6th Edition
Proteīni, kas piedalās baktēriju DNS replikācijā
vadošā pavediena matrica
slīdošā skava
jaunsintezētais pavediens
DNS polimerāze uz vadošā pavediena
replicējamā DNS
nākošais Okazaki
fragments sāksies šeit
RNS praimeris
DNS helikāze
praimāze
jaunais Okazaki fragments
praimosoma
vienpavediena DNS saistošie proteīni
atpaliekošā pavediena matrica
skavas uzlicējs
DNS polimerāze uz atpaliekošā pavediena
(nupat pabeigusi Okazaki fragmenta sintēzi)
Proteīni, kas piedalās DNS replikācijā, ir apvienoti replikācijas kompleksā
vadošā pavediena
matrica
jaunsintezētais pavediens
DNS polimerāze uz vadošā pavediena
praimāze
replicējamā DNS
vienpavediena DNS
saistošie proteīni
DNS helikāze
atpaliekošā pavediena
matrica
RNS praimeris
jaunais
Okazaki fragments
Bakteriofāga T4
replikācijas komplekss
jaunsintezētais
vadošais pavediens
skavas uzlicējs
jaunsintezētais
pavediens
DNS polimerāze uz atpaliekošā pavediena
(nupat pabeigusi Okazaki fragmenta sintēzi)
jaunsintezētais
atpaliekošais
pavediens
replicējamā
DNS
DNS replikācija tiek iniciēta noteiktās hromosomu vietās
replikācijas iniciācijas vieta [origin; ori]
DNS dubultspirāles
lokāla atvēršana
RNS praimera sintēze
sākas vadošā
pavediena sintēze
RNS praimeru un pārējo
DNS pavedienu sintēze
vadošais pavediens 2
atpaliekošais pavediens 1
replikācijas burbulis
vadošais pavediens 1
DAKŠA 1
atpaliekošais pavediens 2
DAKŠA 2
Tās satur specifiskas secības, kuras atpazīst iniciatorie proteīni
Replikācijas iniciācijas vieta
AT-bagāta secība
iniciatorie proteīni
DNS helikāze saistīta
ar helikāzes inhibitoru
DNS
INICIATORO PROTEĪNU
SAISTĪŠANĀS AR ORI
DNS HELIKĀZES SAISTĪŠANĀS AR
INICIATORAJIEM PROTEĪNIEM
helikāzes
inhibitors
DNS HELIKĀZES SAISTĪŠANĀS
AR DNS PAVEDIENU
HELIKĀZE ATVIJ DUBULTSPIRĀLI
UN SAISTA PRAIMĀZI, VEIDOJOT
PRAIMOSOMU
praimāze
DNS polimerāze
uzsāk vadošā
pavediena sintēzi
RNS
praimeris
RNS PRAIMERA SINTĒZE ĻAUJ
DNS POLIMERĀZEI UZSĀKT
PIRMĀS DNS ĶĒDES SINTĒZI
PĀRĒJO TRĪS DNS ĶĒŽU
INICIĀCIJA UN REPLIKĀCIJAS
DAKŠU VEIDOŠANĀS
DIVAS REPLIKĀCIJAS DAKŠAS , KAS
PĀRVIETOJAS PRETĒJOS VIRZIENOS
Baktēriju hromosomas tiek replicētas no viena replikācijas iniciācijas punkta
ori
replikācija
replikācijas
dakšas
Eikariotu hromosomas tiek replicētas no daudziem replikācijas iniciācijas punktiem
telomēra
ori
kodola
membrāna
centromēra
mitotiskā
vārpstiņa
DNS replikācija
kinetohora
mitoze
Molecular Biology of the Gene, 5th Edition
Eikariotu hromosomām ir vairāk ori, kā nepieciešams
iniciācija uz 3. un 5. ori
iniciācija uz 1. ori;
ori 2 tiek replicēts pasīvi
ori 4 tiek replicēts pasīvi
Molecular Biology of the Gene, 5th Edition
Nukleosomas tiek atjaunotas tūlīt pēc DNS replicēšanas
H2A-H2B dimērs
replikācijas dakša
histonu pievienošana un
jaunu nukleosomu
veidošana
H3-H4 tetramērs
hromatīns
Molecular Biology of the Cell, 4th Edition
Arī to modifikācijas var tikt atjaunotas (šūnu ‘atmiņa’ jeb epiģenētiskā
iedzimtība)
histonu modifikācijas
sākotnējās nukleosomas
(ar modificētiem histoniem)
tikai pusei no jaunsintezētās
DNS ir sākotnēji modificētie
histoni
histonu modifikācijas tiek pilnībā
atjaunotas pēc DNS replikācijas
Hromatīna struktūras pārmantojamība ir 1 no EPIĢENĒTISKĀS iedzimtības mehānismiem
ĢENĒTISKĀ IEDZIMTĪBA
EPIĢENĒTISKĀ IEDZIMTĪBA
gēns X aktīvs
gēns Y aktīvs
HROMATĪNA
STRUKTŪRAS MAIŅA
DNS NUKLEOTĪDU
SEKVENCES MAIŅA
gēns X inaktivēts
gēns Y inaktivēts
SOMATISKO ŠŪNU ATTĪSTĪBA
gēns X neaktīvs
gēns X neaktīvs
gēns Y neaktīvs
gēns Y neaktīvs
DZIMUMŠŪNU ATTĪSTĪBA
gēns X neaktīvs
gēns Y aktīvs
Epiģenētiskā iedzimtība: Fenotipisko izmaiņu iedzimtība, kas nav saistīta ar DNS nukleotīdu sekvences izmaiņām.
Hromosomu galu replikācijas problēma
pēdējais Okazaki
fragments
Okazaki fragmentu
savienošana
nepilnīgi
replicēta DNS
nākamā replikācija
Molecular Biology of the Gene, 6th Edition
hromosoma
kļuvusi īsāka
Problēmu risina hromosomu galu struktūra un ferments TELOMERĀZE
telomerāze
telomerāzes
RNS
telomēra
DNS sintēze
telomerāze pagarina
telomēras 3’-galu
pagarinātais 3’-gals kalpo
kā matrica jaunam
Okazaki fragmentam
telomēras pagarinājums
(joprojām raksturīgs
3’-vienpavediena rajons)
Molecular Biology of the Gene, 6th Edition
pārvietošanās
DNS sintēze
atkārto
Baktēriju hromosomām galu nav, un nav
arī to replikācijas problēmas; taču ir cita
topoizomerāze II
Molecular Biology of the Gene, 6th Edition
Vīrusu vienpavediena genomu replikācija
noris caur komplementārā pavediena sintēzi
Vienpavediena
(DNS vai RNS) genoms
Komplementārā
pavediena sintēze
Jaunu genoma
kopiju sintēze
Kāpēc ģenētiskā informācija visās šūnās
tiek glabāta divpavedienu DNS formā?
divpavedienu DNS
ūdeņraža saites
cukura-fosfāta
starp bāžu pāriem
skelets
DNS dubultspirāle