Transcript Slayt 1 - Toraks
IN VİTRO ARAŞTIRMA YÖNTEMLERİ
Prof. Dr. Hasan Bayram Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları AD E-posta: [email protected]
Toraks 11.Yıllık Kongresi, Antalya Nisan 2008
Amaç
• Deneysel araştırmada kullanım alanları konusunda genel bilgi sahibi olma • Solunum yolunun hücre dizileri ile primer hücre kültürlerinin elde ediliş yöntemleri hakkında bilgi sahibi olma • Bu kültürlerin araştırmalarda sunduğu olanaklar ile kullanılan yöntemler hakkında bilgi sahibi olma
in vitro
yöntemler ve • Katılımcıları bu yöntemleri öğrenme ve kullanmaları konusunda teşvik etme
Sunu Akışı
• Giriş; – Araştırma laboratuarı – Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
• Genel olarak
in vitro
araştırma yöntemleri • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Özet
Sunu Akışı
• Giriş; – Araştırma laboratuarı – Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
• Genel olarak
in vitro
araştırma yöntemleri • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Özet
İn Vitro
Araştırma Laboratuarı
• Nasıl kurulur?
• Kaynak; DPT, Üniversite fonları, TÜBİTAK • Profesyonel destek • Personel; biyolog, teknisyen, asistan
İn vitro
yöntemler nerede kullanılır?
• •
İn vivo
koşullarda alınan bir örneğin incelemesi; – Periferik kan, idrar, dışkı, BOS vs.
– Ekspirasyon havası, balgam, biyopsi, BAL – Deney hayvanlarından alınan örnekler; kan, hava yolu akciğer sıvıları, akciğer dokusu
İn vitro
koşullarda doku ve hücre kültürü elde edilmesi ve incelenmesi – Periferik kan kültürleri; mono nükleer hücreler, eozinofil vs – Hava yolu hücre kültürleri; Hücre dizileri, primer hücre kültürleri vs
İn Vitro
Yöntemler Niçin Kullanılır?
• Bir enzim, elementin direkt ölçümü; ALT, AST, Na, K vs • Hücre fonksiyon/bütünlüğünün araştırılması; silya titreşimi, elektriksel direnç, permabilite • Hücrenin canlılığı; MTT (tetrazolium tuzu), trypan blue • Anahtar bir proteinin belirlenmesi; ELISA, Western Blot • Gen düzeyindeki bozukluk/aktivasyonunun incelenmesi: PCR, RT-PCR • Bir protein/antijenin ekspresyonu; immüno-sito kimya • Hücrelerin (büyüklük/eksprese ettiği belirtece göre) ayrılması/belirlenmesi; akım sitometri (‘flow cytometry’)
Sunu Akışı
• Giriş; – Araştırma laboratuarı – Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
• Genel olarak
in vitro
araştırma yöntemleri • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Özet
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)/Enzyme ImmunoAssay (EIA)
(‘capture ab’) (Nümune) (‘detecting ab’) (‘enzime bağlı secondary ab’) (Substrat)
ELİSA
ImmunoSito/Histokimya
Enzimatik Yöntem Floresan Yöntemi
‘Blotting’ (leke)
• Southern blot; DNA dizisi (sequence,sekans) • Western blot; protein antibody ile • Northern blot; gen ekspresyonu RNA ile • Southwestern blot: DNA bağlı protein • Far-western blot: Protein, non-antibody protein ile http://en.wikipedia.org/wiki/Southern_blot
Western Blot (Immunoblot) •Doku homojenatı/ekstraktı, hücre •Spesifik proteini, düzeyini belirlemek
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Microarray (Mikrodizi)
• DNA microarray’leri; cDNA microarray, oligonucleotide microarrays • Protein mikroarray • Tissue mikroarray • Transfection mikroarray (hücre microarray) • Kimyasal bileşik mikroarray • Antibody mikroarray • Gene Chip Analizleri
DNA Mikroarray
•Gen/genom chip, DNA chip, gen array •Tek bir geni temsil eden mikroskobik DNA spotlarının bir kolleksiyonu •Diğer arraylar’dan farkı ya DNA’yı ölçer, ya da ölçüm sistemlerinin bir parçası olarak DNA’yı kullanırlar.
Genomic
•Bir organizmanın bütün genomunun araştırılması •Organizmaların bütün DNA dizilerinin(sekans) tespitine dayalı çalışmalar
Proteomic
•‘Genomic’ ile analoji yaratmak amacıyla kullanılır • Genel olarak protein çalışmaları (yapı ve fonksiyonları) • ‘Proteome’; ‘
prote
in’ ve ‘gen
ome
’ dan oluşur.
•Bir organizma tarafından üretilen tüm proteinler
Small Interfering RNA (siRNA)
•‘short interfering RNA’ veya ‘silencing RNA’ • Spesifik rolleri olan 20-25 nükleotid uzunluğunda çift-sarmal RNA moleküllerinden oluşur.
• siRNA transfeksiyon yoluyla hücreye verilerek
Spesifik geni etkisizleştirme de (knock down) kullanılabilir
Flow Cytometry
• DNA (hücre siklüsü, proliferasyonu vs) • Apopitozis çalışmalarında • Hücre yüzey antijenlerinin belirlenmesinde (CD markerları) • Hücre içi antijenler (sitokin, mediatör vs) • Kromozom analiz ve tespitinde • RNA çalışmalarında • Protein ekspresyon ve lokalizasyonunda
http://www.bdbiosciences.com/immunocytometry_systems/ support/training/online/ITF/index.shtml
Akım Sitometri (Flow Cytometry)
•Tek dalga ışın demeti(lazer) sıvı akımına yönlendirilir •Çevredeki detektörler ışığın kırılma yönü, yaydığı floresan ışığının tespitiyle hücre/partiküllerin belirlenmesi esasına dayanır
Hücre Siklüs Ölçümü
Sunu Akışı
• Giriş; – Araştırma laboratuarı – Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
• Genel olarak
in vitro
araştırma yöntemleri • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Özet
Hücre Kültürleri
•
İn vivo
uygulamalarda etik, güvenlik sorunları • Uygun çalışma modeli • Hücre fizyolojisi, biyokimyası vb • Patogenez; rinit, astım, KOAH, kanser • Toksikoloji; kimyasallar, zehirler, çevresel irritanlar (hava kirliliği), biomas • Terapötik; Ca tedavisi, steroidler, 2 agonist, teofilin, yeni ajanlar, vs
Hücre Dizileri (‘Cell line’)
• Normal hücreler (ölümsüz) ‘immortal’ hale getirilirler (viruslar, SMV40); – BEAS-2B (Bronş epitel hücreleri) – 16 HBE-14o- hücreleri (Bronş epitel hücreleri) • Kanserleşmiş hücreler kullanılır – A549 hücreleri (akciğer karsinoma hücreleri) NHLI Cell Culture Protocols, American Type Culture Collection
• DMEM, %10 FCS, 2mM L-glutamine • Tek katman (‘monolayer’) oluşturur A549 (İnsan Alveolar Epitel Hücreleri) (Hoffman Modüle Kontrast Mikroskobu x400)
Dizel Egzoz Partikülleri DEP (medyan=0.4
m)
Hücre Canlılığı - MTT
SF FCS %10 50 100 200 400 5 10 Dizel Egzoz Partikülleri ( g/ml)
D EP’nin A549 hücre canlılığı üzerine etkisi ***p<0.0001 - 0 g/ml DEP 2.0
1.5
* 1.0
0.5
*
48 saat
* * * * 0.0
FCS (%10) 0 5 10 50 100 200 400 10 00 20 00 Dizel Egzoz Partikülleri ( g/ml)
24 saat
2.0
1.5
* * 1.0
* 0.5
* 2.0
0.0
FC S (%10) 0 5 10 50 100 200 400 1000 2000 Dizel Egzoz Partikülleri ( g/ml)
72 saat
1.5
1.0
0.5
* * * 0.0
FCS (%10) 0 5 10 50 100 200 400 1000 2000 Dizel Egzoz Partikülleri ( g/ml)
DEP (10-1000 g/ml) ile 72s İnkübasyonun A549’dan Sitokin Salınımına Etkisi
5000 4000 3000
*
2000 1000 0 0 10 50 10 0 20 0 40 0 Serum Dizel Egzoz Partikülleri (
g/ml) 15 10 5
*
0 0 10 50 10 0 20 0 40 0 10 00 Serum Dizel Egzoz Partikülleri (
g/ml)
100 75 50
DEP (10
g/ml) ’nin A549 hücre proliferasyonuna etkisi
** *** 0 50 SF 200 G0G1 G2M S-Phase Sync Wizard Model File: Data.002
Date acquired: 06-Jun-03 Date analyzed: 6-Jun-2003 G0G1: 75.81 % Mean: 53.79
CV: 4.94 % G2M: 10.98 % Mean: 97.36
G2/G1: 1.81
S-Phase: 13.21 % Mean: 76.25
Compartment 1: 4.03 % Compartment 2: 4.70 % Compartment 3: 4.47 % Modeled Events: 8835 RCS: 4.671
250 100 150 Channels (FL2-H) Serum Free DEP (10 g/ml) FCS (10%) 25 0 *** *** * ** G 0/1 S Cell cycle compartments ModFitLT V3.0(Win32) G 2 /M Bayram H et al, Eur Respir J 2006
DEP (10 g/ml) ’nin A549 hücre apoptozisine etkisi 100 70 * **
SF
FCS(10%) SF DEP (10 g/ml) 40 30 20 10 0 LL(A-/P-) * * *P<0.05 and **P<0.005 vs SF LR(A+/P-) UR(A+/P+) Kuadrantlar UL(A-/P+) Bayram H et al, Eur Respir J 2006
150 DEP ’nin A549 hücre p21 CIP1/WAF1 protein ekspresyonuna etkisi 100 50 ** 0 10% FCS 0 * 1 10 DEP ( g/ml) 0 1 10 10% FCS p21 CIP1/WAF1 -actin *P<0.05 and **P<0.01 vs 0 g/ml DEP
DEP (10 g/ml) ile 48 saat inkübasyonun A549 hücre p21 CIP1/WAF1 mRNA ekspresyonuna etkisi 400 *P<0.05 vs SF 300 * 200 100 0 0 1 DEP( g/ml) 10
Sunu Akışı
• Giriş; – Araştırma laboratuarı – Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
• Genel olarak
in vitro
araştırma yöntemleri • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Özet
Primer Hücreler
-Avantajlar
•
İn vivo
ortamdaki hücrelerle genotipik ve fenotipik benzerlik • Çeşitli patolojilerde, hastalardan direkt olarak elde edilebilirler
Primer Hücre Kültürü Dezavantajlar
• Elde edilmeleri daha zor • Tekrar tekrar çoğaltılıp kullanılamazlar • Etik sorunlar
Doku Hücre Kaynağı
• Cerrahi eksplant – Pnömonektomi, Lobektomi – Transplant akciğeri • Biyopsi • Fırçalama (epitel hücreler) • Enzimatik digestion, • Disseksiyon • Hazır, ticari olarak
Akciğerin Primer Hücre Kültürleri
• Düz kas hücreleri • Fibroblast kültürleri • Alveolar epitel hücreleri • Bronş epitel hücreleri
Primer Bronş Epitel Hücre Kültürleri •
• Fırçalama, • Enzimatik digestion,
Disseksiyon
Bronş Epitelyumunun Disseksiyonu
Kültür Vasatı
• ‘Medium 199’ – Foetal bovine serum (2.5ml) – 1ml bovine pancreatic insulin (2.5 g/ml) – 1ml human transferrin (2.5 g/ml) – 1ml epidermal growth factor (20 g/ml) – 1ml hydrocortisone (0.36 g/ml) – 1ml L-glutamine (0.02mg/ml) – 1ml antibiyotik/antimikotik solüsyon • 100ml tamamlanır ve 0.2
m por çap filtreden geçirilir
Kültür Kapları
6cm çaplı, Falcon ‘Primaria ® ’’ plastik kültür kapı (Becton Dickinson,UK) 9mm çaplı 24 gözlü, 0.45
m por çaplı hücre kültür ‘insert’ diagramı
24-Kuyucuklu Plate
1. Hafta 3. Hafta (Hoffman Modulation Contrast Işık Mikroskopu, x300)
Hücrelerin DEP ile İnkübasyon
Silya Titreşim Frekansının Ölçülmesi
DEP’nin bronş epitel hücre silya titreşim frekansına etkisi Bayram H, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 1998.
Normal kültür ortamında astmatik ve non-astmatik bronş epitel hücrelerinden inflamatuar mediatör salınımı pg/ g selüler protein 1000 (log.) p <0.05
Non-ast.
p<0.003
Ast.
100 p<0.002
10 1 0,1 0,01 YK IL-8 GM-CSF RANTES sICAM-1 Bayram H, et al. J Allergy Clin Immunol 1998.
İn vitro
Ozon –NO 2 Maruziyet Düzeneği %5 CO 2 İn Air NO 2
Kültürlerin Elektriksel Direncinin Ölçüm Düzeneği
Ozon ve NO 2 ’e 2-6s maruziyetin atopik astmatik bronş epitel hücre kültürlerinin elektrik direncine etkisi Bayram H, et al. Clin Exp Allergy 2002.
Sunu Akışı
• Giriş; – Araştırma laboratuarı – Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır?
• Genel olarak
in vitro
araştırma yöntemleri • Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı • Özet
Özet
• • Bir araştırma laboratuarı kurmakla başlanmalı
İn vitro
yöntemler çok çeşitli araştırmalarda kullanılabilirler • Akciğer hücre dizi ve primer hücre kültürleri yapılabilir • Solunum yolu hücrelerinin – Fizyolojik – Biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi – Çeşitli patolojilerdeki rollerinin aydınlatılmasında kullanılabilir
Yorum
• Bütün dünyada yaygın olarak kullanılan
in vitro