Transcript reactia ag-ac

REACTII Ag. – Ac.
CATEDRA DE MICROBIOLOGIE
LP9
REACŢIA DE AGLUTINARE
Din latină: agglutinatio – încleiere
Reacţia Ag-Ac se poate manifesta prin aglutinare, atunci
când determinantele antigenice sunt purtate de particule
figurate (Ag. insolubile corpusculare), iar Ac. specifici sunt
compleţi (cel puţin bivalenţi).
Aglutinarea este determinată de formarea unei reţele între
Ag. şi Ac., ce permite apropierea unui număr suficient de
particule figurate pentru a constitui aglutinate vizibile cu
ochiul liber.
Ac. IgM cu 10 epitopi potenţiali aglutinează mai activ decât
Ac. IgG.
REACTII DE AGLUTINARE
CLASIFICARE
• Reactii de aglutinare directa
• reactii de aglutinare “pe lama”
• reactii de aglutinare in tuburi
• Reactii de aglutinare indirecta (pasiva sau
pe suport)
REACTII DE AGLUTINARE
“PE LAMA”
• Principiu: Ag. somatic “O”
Ag. flagelar “H”
Ag. capsular “K”
Ac. omologi
agregate vizibile cu ochiul liber
* numai aglutinarea rickettsiilor sau leptospirelor trebuie
urmarita microscopic!
REACTII DE AGLUTINARE
“PE LAMA”
• Indicatii:
– Completeaza identificarea biochimica
prezumtiva a unor bacterii (ex. Salmonella,
Shigella, Yersinia etc.)
– Identifica serovaruri ca markeri de
patogenitate (ex. Haemophilus influenzae tip
b, tulpinile EPEC, EIEC etc.) ori
epidemiologici
REACTII DE AGLUTINARE
“PE LAMA”
• Proba: cultura pura, proaspata, a tulpinii
de testat pe panta de TSI, de agar nutritiv
sau pe un mediu diferential
• Necesar: baterie cu seruri de referinta
polivalente si monovalente specifice de
grup / tip diluate, la titrul indicat de
producator, in solutie salina izotona
fenolata 0,2%.
REACŢIA DE AGLUTINARE
“PE LAMA”
• Citire si interpretare:
Test (+): aglutinare evidenta in interval de 1’
in picatura cu ser imun, absenta
aglutinarii la martor.
Test (-): absenta aglutinarii in ambele
picaturi.
Daca s-a obtinut aglutinare cu serul polivalent, se
va continua testarea suspensiei cu serurile
monovalente corespunzatoare.
REACŢIA DE AGLUTINARE
IN TUBURI
• Indicatii:
– confirmarea rezultatelor aglutinarii pe
“lama” sau transarea lor cand sunt
incerte (aglutinari cu mai multe seruri,
aglutinari tardive)
– titrarea aglutininelor pentru Dg.
seroimunologic
REACŢIA DE AGLUTINARE
IN TUBURI
Necesar:
a. Pentru confirmarea identitatii antigenice:
Suspensia Ag.-ica preparata diferentiat cu
tipul Ag. Implicat:
 Ag. H (ex. Salmonella): cultura de 8 h. in bulion, cu
mobilitate verificata microscopic, formolata 0,2%)
 Ag. O: suspensie din cultura de 20 h. pe agar nutritiv
inactivata 1 – 2,5 h. la 100° C daca bacteria este
mobila sau are Ag. de invelis care o pot face
inaglutinabila prin seruri anti – O (ex.: Ag. K la Shigella
subgrup A, C, D, Ag. L si B la E. coli, Ag. Vi la
Salmonella). Bacteriile imobile sau fara Ag. K pot fi
folosite in suspensii vii.
REACŢIA DE AGLUTINARE
IN TUBURI
 Ag. de invelis K si variantele sale: suspensie
din cultura de 20 h. pe agar nutritiv, formolata
0,2%.
Serul de referinta – indicat de rezultatul
aglutinarii pe lama.
b. Pentru Dg. Imunoserologic:
 probe de ser prelevate in dinamica
 Ag. de referinta
REACŢIA DE AGLUTINARE
IN TUBURI
• Citire si interpretare:
– se interpreteaza comparativ cu tubul martor,
pentru stabilitatea suspensiei de Ag., se
observa supernatantul, si cu ajutorul oglinzii,
fundul tubului.
– Aglutinatul H – apare floconos, usor disociabil
prin agitare
– Aglutinatele O si K – dense, grunjoase.
REACŢIA DE AGLUTINARE
IN TUBURI
• Se folosesc urmatoarele simboluri pentru
intensificarea reactiei:
• 0 = aspect identic cu martorul
• 1+ = depozit absent, aglutinare vizibila numai la
marire cu oglinda concava
• 2+ = supernatant usor opalescent, aglutinat depus,
cvasifloconos sau grunjos, vizibil cu ochiul liber
• 3+ = supernatant foarte usor opalescent, depozit
floconos, respectiv grunjos, cu tendinta de formare
de pelicula
• 4+ = supernatant perfect clar, depozit floconos
bogat, respectiv pelicula continua, omogena de
aglutinare, care acopera fundul tubului (“umbrela”).
REACŢIA DE AGLUTINARE
IN TUBURI
• Titrul este indicat de tubul de aglutinare +2.
Pentru Dg. Imunoserologic se folosesc
urmatoarele reactii:
 reactia Widal – dg. febrelor tifoide si
paratifoide
 reactia Wright – dg. brucelozei
 reactia Weil – Felix – dg. tifosului exantematic
REACTII DE AGLUTINARE
INDIRECTA (PASIVA sau PE
SUPORT)
• Agregarea specifica imunochimica a unor
particule (eritrocite, particule de latex, mai
rar, bentonita, carbune, colodiu etc.)
“coafate” cu Ag. sau Ac. pentru a putea
identifica Ac., respectiv Ag. lor specifice.
• Ag. / Ac. – atasati pe diferite suprafete
– fie prin legaturi covalente,
– fie prin forte intermoleculare electrostatice
REACTII DE AGLUTINARE
INDIRECTA (PASIVA sau PE
SUPORT)
• In proba de testat: ser sangvin, LCR,
fecale, urina etc.) – putem detecta Ag. Sau
Ac., in functie de elementul atasat de
suport (Ac. / Ag.)
REACTII DE AGLUTINARE
INDIRECTA (PASIVA sau PE
SUPORT)
• COAGLUTINAREA – aglutinare indirecta
care foloseste ca suport tulpina Cowan de
Staphylococcus aureus (ATCC 12498), a
carei proteina A fixeaza Ac. prin fragmentul
Fc, lasand reactive fragmentele Fab. Astfel,
coaglutinarea este folosita pentru detectarea Ag.
• 27-1cd2be0728.jpg
REACTII DE AGLUTINARE
INDIRECTA (PASIVA sau PE
SUPORT)
• teste de mare sensibilitate care permit si determinari
semicantitative.
• Firme (Oxoid, bio Mérieux, Sanofi – Pasteur) ofera truse
variate pentru:
• Detectarea rapida si sensibila, direct in prelevate patologice,
a unor Ag.
– Bacteriene (streptococi grup A, B, pneumococi, meningococi,
Haemophilus influenzae tip b, E. coli K1)
– Fungice (Cryptococcus neoformans, Candida,
Aspergillus)
– Virale (rotavirus, Ag. HBS)
– Enterotoxine (stafilococice, Clostridium perfringens,
Bacillus cereus)
REACTII DE AGLUTINARE
INDIRECTA (PASIVA sau PE
SUPORT)
• Identificarea rapida a unor izolate ca:
– streptococii de grup A, B, C, D, F, G
– E. coli O157
– Listeria monocytogenes
– Legionella pneumophila
• Identificarea rapida a unor toxine din
filtratul culturilor bacteriene.
REACTII DE AGLUTINARE
INDIRECTA (PASIVA sau PE
SUPORT)
• Dg. Imunoserologic prin aglutinare pasiva:
– Mononucleoza infectioasa prin detectarea Ac.
Heterofili
– Infectia cu Helicobacter pylori
– Detectarea titrurilor semnificative ale ASLO,
Proteinei C reactive, factorului Rheumatoid,
RPR – carbon
- Dg. de certitudine al sifilisului (TPHA) – reactii de
hemaglutinare
REACTII DE LATEX AGLUTINARE
REACTIA DE HEMAGLUTINARE
PASIVA (HAI)
Unele Ag. de origine polizaharidica se fixeaza, practic,
spontan, dupa o scurta incubatie pe suprafata hematiilor.
Antigenele proteice se fixeaza doar dupa o pregatire
prealabila a hematiilor (ex. tratarea cu tanina,
formol).
RHAI se efectuează in godeurile unei placi din
polistiren.
Reactia (+) se manifesta prin aglutinarea
eritrocitelor sensibilizate (“umbrela” inversata de
culoare bruna la fundul godeurilor).
RFC – REACTII DE FIXARE A C’
• Principiu: asociaza 2 complexe Ag. – Ac.
care isi disputa C’:
– I: un cuplu virtual posibil, in care unul din
reactanti este cunoscut, iar reactantul omolog
poate fi prezent sau nu
– al – II- lea cuplu: este preformat prin reactia
hematiilor de berbec cu serul anti – hematii de
berbec (cuplul hemolitic).
RFC – REACTII DE FIXARE A C’
• Daca I-ul cuplu se formeaza activeaza
(“fixeaza”) C’ pe calea clasica. Rar, fixarea C’ pe
un cuplu Ag. – Ac. este vizibila in vitro. De aici,
necesitatea de a testa remanenta C’ in sistem
printr-un cuplu indicator, cuplul hemolitic.
• Daca in sistem persista C’ activ, primul cuplu nu
s-a format , iar hematiile sunt lizate = reactie
negativa.
• In absenta C’, “fixat” pe I-ul cuplu, hematiile nu
sunt lizate = reactie pozitiva.
RFC – REACTII DE FIXARE A C’
REACTIE
POZITIVA
REACTIE
NEGATIVA
PRIMA
REACTIE
Ser imun (Ac.)
Ag. Microbian
C’
+
+
+
+
+
A DOUA
REACTIE
Hematii de oaie
Ser hemolitic
anti - oaie
+
+
Absenta
hemolizei
+
+
Hemoliza
RFC – REACTII DE FIXARE A C’
• Indicatii:
• Identificarea Ag. specifice de grup
• Pentru seroDg., cand cu baterii de Ag. cunoscute,
putem titra Ac. fixatori de C’, care, de regula,
persista pana la un an de zile.
Acesti Ac. Apar precoce in cursul infectiilor, deci
semnificatia prezentei lor este de infectie acuta
sau recenta; exceptie fac unele infectii ale SNC
cand apar tardiv.
RFC – REACTII DE FIXARE A C’
• Utilitate:
• Dg. infectiilor respiratorii acute: gripa, pneumonii
interstitiale
• Dg. rickettsiozelor
• Dg. leptospirozelor
REACTII PRIMARE
RIA – RADIOIMUNODOZARE
• Ag. pot fi marcate cu izotopi radioactivi (3H, 125I, 14C).
• Exista o competitie specifica pentru Ac. intre o cantitate
cunoscuta de Ag. radioactiv si Ag. nemarcat pe care il
dozam.
• Dupa reactie masuram radioactivitatea complexului Ag. –
Ac. Pentru aceasta, fie Ac. este in prealabil fixat pe un
suport insolubil, fie complexul este precipitat cu ser anti
– Ig.
• [Ag. nemarcat] o aflam comparand radioactivitatea
complexului cu o curba standard.
• Metoda foarte sensibila pentru cuantificarea Ag. si
haptenelor.
REACTII PRIMARE
RIA – RADIOIMUNODOZARE
• Indicatii:
• Dozarea hormonilor
• Dozarea medicamentelor
• Dozarea markerilor specifici infectiei cu v. hepatitei
B (Ag. HBs, Ac. anti – HBs, Ac. anti – HBc,
Ag. HBe, Ac. Anti – HBe)
Dezavantaje:
cost ridicat al materialelor
riscul manipularii substantelor radioactive
REACTII PRIMARE
ELISA – Enzyme Immunoassay –
EIA)
• Principiu: prezenta complexelor Ag – Ac
poate fi vizualizata si cuantificata prin
adaugarea in mediul de reactie:
• a conjugatului – fie Ag., fie un Ac. cunoscut cuplat
cu o enzima
• a substratului cromogen specific enzimei de
marcare
REACTII PRIMARE
ELISA – Enzyme Immunoassay –
EIA)
• Indicatii: identificarea unor Ag. sau Ac.
• In functie de modificarea activitatii
markerului enzimatic, EIA pot fi clasificate
in:
– Reactii de “faza omogena”
– Reactii de “faza heterogena”
REACTII PRIMARE
IMUNOFLUORESCENTA
• Principiu: conjugate imunofluorescente
realizate cu Ac. specifici recunosc Ag.
dintr-un mediu de reactie, permitand
evidentierea lor microscopica.
• Reactia de culoare obtinuta difera in
functie de fluorocromul utilizat.