Transcript Bảo quản - Vận chuyển bệnh phẩm cúm A

Hướng dẫn kỹ thuật lấy mẫu, bảo
quản và vận chuyển bệnh phẩm
cúm A
ThS. Nghiêm Mỹ Ngọc
Khoa Xét Nghiệm
Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới
Tháng 04 năm 2014
Nội dung



Mục đích và tầm quan trọng của việc lấy
mẫu xét nghiệm
Phương pháp lấy mẫu, bảo quản và vận
chuyển bệnh phẩm cúm A
Xét nghiệm chẩn đoán virus cúm A
Mục tiêu lấy mẫu xét nghiệm




Xác định ca bệnh
Xác định ổ dịch do virus
Theo dõi sự biến đổi gen của virus
Phát hiện đột biến kháng thuốc
Nguyên tắc lấy bệnh phẩm

Đảm bảo chất lượng của xét nghiệm virus cúm
A/H7N9





Thời điểm lấy bệnh phẩm
Loại bệnh phẩm
Chất lượng của bệnh phẩm
Điều kiện bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm
Đảm bảo các quy tắc an toàn sinh học



Lấy bệnh phẩm
Vận chuyển bệnh phẩm
Thực hiện xét nghiệm cúm A/H7N9
Tiêu chuẩn chất lượng mẫu bệnh phẩm

Đúng thời điểm
3 ngày đầu của bệnh
 Trước khi dùng thuốc kháng virus




Đúng chủng loại
Đúng thao tác
Bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm
đúng cách
Bệnh phẩm xét nghiệm cúm A
Mục tiêu phát hiện
Loại bệnh phẩm
Kỹ thuật xét nghiệm
Vật liệu di truyền RNA
của virus
Tế bào biểu mô đường
hô hấp
Dịch tiết đường hô hấp
- RT PCR
- Real time RT-PCR
- Nucleotide sequencing
Kháng nguyên virus
- Test nhanh
- Miễn dịch sắc kí
Virus toàn vẹn
Cấy phân lập trên tế bào
hoặc phôi trứng gà
Kháng thể kháng virus
Huyết thanh
- Hemagglutination
Inhibition Test.
- Micro-Neutralization
Assay
Bệnh phẩm xét nghiệm cúm A

Đường hô hấp trên




Đường hô hấp dưới



Dịch họng
Dịch mũi
Dịch tỵ hầu
Dịch nội khí quản
Dịch phế nang
Huyết thanh
Giai đoạn cấp
 Giai đoạn hồi phục
(2 mẫu cách nhau 10-14
ngày)

Kỹ thuật lấy mẫu, bảo quản và
vận chuyển bệnh phẩm cúm A

Chuẩn bị thu thập bệnh phẩm



Dụng cụ, môi trường
Phiếu thu thập bệnh phẩm
Sử dụng trang phục bảo hộ cá nhân
Dụng cụ - môi trường

Dụng cụ thu thập bệnh phẩm








Tăm bông vô trùng
Dây nhựa mềm (catheter)
Cây đè lưỡi
Dây garo
Bơm tiêm vô trùng
Túi nylon để gói bệnh phẩm
Bình lạnh bảo quản mẫu
Dung dịch sát trùng: ethanol
70%, chlorine (Sodium
hypochlorite) hoặc Chloramine B
Dụng cụ - môi trường

Môi trường vận chuyển virus




Do Viện Pasteur TPHCM hoặc
BV. Bệnh Nhiệt Đới cung cấp
Thành phần: albumine bò,
kháng sinh, kháng vi nấm, phenol
red
Bảo quản ở 2-8oC
KHÔNG dùng khi môi trường có
màu đục hay chuyển từ màu
hồng sang tím hoặc vàng
Môi trường vận chuyển virus
(VTM)
Phiếu thu thập bệnh phẩm


Phụ lục 6, thông tư 43/2011/TTBYT ngày 5/12/2011 của Bộ
trưởng Bộ Y tế
Bao gồm thông tin





Bệnh nhân
Loại bệnh phẩm
Ngày thu thập
Dịch tễ
Gởi kèm theo mẫu bệnh phẩm
Hướng dẫn cách lấy bệnh phẩm

Dịch mũi




Đưa tăm bông vào dọc theo
sàn mũi tới khoang mũi họng
Để tăm bông thấm ướt dịch mũi
Xoay tròn, miết mạnh vào thành
mũi và rút ra từ từ
Cho tăm bông vào lọ đựng mẫu
đã có sẵn môi trường vận
chuyển.
Chất lượng chẩn đoán tốt hơn
phết họng đối với cúm người
Hướng dẫn cách lấy bệnh phẩm

Dịch họng



Đưa tăm bông vào vùng hầu
họng để cho dịch thấm ướt đầu
tăm bông.
Miết mạnh và xoay tròn tăm
bông tại khu vực 2 amidan và
thành sau họng
Cho tăm bông vào lọ đựng mẫu
có môi trường vận chuyển.
Chất lượng chẩn đoán tốt hơn
phết mũi đối với cúm A/H5N1
Hướng dẫn cách lấy bệnh phẩm

Dịch mũi hầu (NPA)





Nối dụng cụ lấy mẫu với hệ thống hút chân không
Đưa catheter vào mũi theo hướng song song với vòm miệng, độ
sâu bằng đường nối mũi, tai.
Từ từ đưa catheter ra ngoài vừa đưa ra vừa xoáy.
Tương tự như vậy với mũi bên kia, có thể sử dụng chung một
catheter.
Hút 3 ml dung dịch vận chuyển để rửa catheter, chia mẫu vào lọ
đựng mẫu.
Cho kết quả nhạy hơn phết mũi/ phết họng
Tối ưu cho xét nghiệm cúm A (WHO)
Hướng dẫn cách lấy bệnh phẩm

Dịch nội khí quản



Dùng 1 ống hút dịch đặt theo
đường nội khí quản
Dùng bơm tiêm hút dịch nội khí
quản theo đường ống đã đặt từ
1-2 ml
Chuyển dịch khí quản vào ống
chứa sẵn 3 ml môi trường vận
chuyển virus
Bệnh phẩm cho độ nhạy cao nhất
Dịch khí quản trong VTM
Hướng dẫn cách lấy bệnh phẩm

Mẫu huyết thanh (phát hiện kháng thể)



Lấy 3-5 ml máu tĩnh mạch cho vào lọ không có chất chống đông
Ly tâm mẫu máu tốc độ thấp 2000 v/p để tách huyết thanh
Lấy máu kép:
 Máu 1: lấy càng sớm càng tốt
 Máu 2: lấy cách 10-14 ngày
Huyết thanh
Gel ngăncách
Cục máu đôn
Mẫu huyết thanh
Bảo quản mẫu bệnh phẩm cúm



Giữ trong môi trường vận
chuyển virus (VTM)
Nhiệt độ thích hợp
 4oC trong 48 giờ
 - 70oC hoặc -20oC trên
48 giờ
Hạn chế làm đông và rã
đông bệnh phẩm nhiều lần
Môi trường vận
chuyển virus (VTM)
Bảo quản mẫu bệnh phẩm cúm

Mẫu huyết thanh (phát hiện kháng thể)
Sau khi quay ly tâm: bảo quản trong tủ lạnh
4oC-8oC trong vòng 10 ngày
 Nếu không có điều kiện ly tâm: bảo quản
trong tủ lạnh 4oC trong 24 giờ
 Nếu cần bảo quản lâu hơn: -20oC hoặc -80oC
 Không làm đông và rã đông nhiều lần

Cách ghi nhãn và phiếu xét nghiệm



Dán nhãn trên mỗi lọ bệnh
phẩm: ghi mã số, họ tên, tuổi
bệnh nhân, loại bệnh phẩm,
ngày lấy bệnh phẩm
Điền đầy đủ thông tin vào
phiếu xét nghiệm
Trên các bao bì bệnh phẩm
phải ghi tên loại bệnh phẩm
(“BỆNH PHẨM CHẨN ĐOÁN”
hoặc “BỆNH PHẨM LÂM SÀNG”)
Nhãn
Nguyên tắc đóng gói bệnh phẩm cúm

Mẫu bệnh phẩm phải được đóng gói ba lớp
 Lớp thứ nhất: không thấm nước, không rò rĩ, có chứa vật
thấm nước.
 Lớp thứ hai: bằng vật liệu bền, không thấm nước (túi
nilon), không rò rĩ.
 Lớp ngoài cùng: đảm bảo chịu lực, chống va chạm. Giữa
lớp thứ hai và lớp ngoài cùng có 1 lớp đệm chống va đập
Nguyên tắc đóng gói bệnh phẩm cúm





Đóng gói riêng biệt với các loại hàng hóa khác
Các ống bệnh phẩm phải được đặt thẳng đứng
Khi đựng nhiều mẫu trong lớp thứ hai: tách riêng
mẫu, tránh tiếp xúc
Ghi nhãn trên bao bì vận chuyển
 Nhiệt độ bảo quản
 Tên loại bệnh phẩm
 Thông tin người gởi và người nhận: tên, địa chỉ,
số điện thoại
Gởi kèm phiếu xét nghiệm và phiếu điều tra dịch tễ
Vận chuyển bệnh phẩm cúm


Do nhân viên y tế thực hiện
Thông báo cho phòng thí nghiệm tiếp nhận




Phương tiện vận chuyển
Thời gian dự kiến sẽ tới phòng thí nghiệm
Lựa chọn phương tiện vận chuyển: đảm bảo
thời gian vận chuyển ngắn nhất.
Các chất bảo quản bệnh phẩm trong quá trình
vận chuyển (đá ướt, đá khô)


Phù hợp các yêu cầu về an toàn khi vận chuyển
Đảm bảo chất lượng bệnh phẩm
Xét nghiệm và thông báo kết
quả xét nghiệm

Đơn vị xét nghiệm khẳng định virus cúm A/H7N9



Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương
Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh
Đơn vị lấy mẫu xét nghiệm: Trung tâm Y tế dự
phòng các tỉnh, thành phố, các bệnh viện


Lấy mẫu bệnh phẩm các trường hợp nghi ngờ do
virus cúm A/H7N9
Đóng gói và vận chuyển đến phòng xét nghiệm
Xét nghiệm chẩn đoán viêm
phổi do virus cúm A
Xét nghiệm sinh hóa-huyết học

Công thức máu ngoại vi


Khí máu


Tăng men gan mức độ nhẹ hoặc trung bình
Đường huyết


Giảm oxy máu khi bệnh tiến triển nặng
Men gan


Một số trường hợp số lượng tế bào TCD4 giảm < 200 tế
bào /mm3
Một số trường hợp có tăng đường huyết
Tăng creatinin trong trường hợp suy thận
Xét nghiệm vi khuẩn

Mục đích
Chẩn đoán phân biệt với bệnh do
vi khuẩn (viêm phổi do phế cầu, vi
trùng lao,…)
 Phát hiện trường hợp bội nhiễm


Phương pháp
Cấy máu
 Soi-cấy đàm và dịch phế quản
 Cấy dịch màng phổi.

Xét nghiệm virus cúm A


Phương pháp nuôi cấy
Phương pháp không nuôi cấy
 Hình thái học
 Miễn dịch học
 Di truyền học
Phôi gà
Tế bào MDCK
Đặc điểm virus cúm A
Neuraminidase (N1-N9)
Hemagglutinin (H1-H16)
RNA
M2 protein
Phân nhóm theo 2 kháng nguyên
 Hemagglutinin (HA) : 16H
 Neuraminidase (NA):9N
Gia cầm có tất cả H và N
Người chỉ có H1, H2, H3 và N1, N2
Thử thách trong chẩn đoán virus cúm A
1918: “Spanish Flu”
Tăng độc lực
&
Mở rộng tế bào chủ
1957: “Asian Flu”
1968: “Hong Kong Flu”
Thử thách trong chẩn đoán virus cúm A




Cúm A chủng pandemic H1N1 2009
Cúm A chủng S-OtrH3N2 2011
Cúm A/H5N1 (cúm gia cầm)
Cúm A/H7N9
Quy tắc về an toàn sinh học
trong phòng Xét nghiệm

Xử lý mẫu bệnh phẩm cúm A
Class II biological safety cabinets

Nuôi cấy, phân lập virus
Lab an toàn sinh học cấp độ 3 (Biosafety Level 3 Lab)
Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới
TP.Hồ Chí Minh
Chứng nhận phòng xét nghiệm
Chứng nhận phòng Xét nghiệm
An toàn sinh học cấp độ III
Sinh Học Phân Tử
Quy trình xét nghiệm virus cúm A
tại BV. Bệnh Nhiệt Đới




Sử dụng quy trình Real-time
RT-PCR của CDC
Thời gian trả kết quả: 24 giờ
Đạt chuẩn ISO15189
Tham gia chương trình ngoại
kiểm của WHO
Nguyên lý PCR (Polymerase Chain Reaction)
Quy trình xét nghiệm virus cúm A
(Quy trình CDC)
Định danh virus cúm A
(H1, H3, H5, H7)
Định danh virus cúm A
(N1, N9)
Chẩn đoán virus cúm A
Chẩn đoán virus cúm B
Quy trình xét nghiệm virus cúm A
Mẫu bệnh phẩm
Tách chiết RNA virus
Real time RT-PCR
Influenza A
Influenza B
H1p2009
H3
Phân tích kết quả
H5
RNP
H7
N9
Biện luận kết quả



Phối hợp với yếu tố dịch tễ và bệnh cảnh
lâm sàng
Bệnh nhân phải được cách ly chờ kết quả
Một kết quả PCR âm tính không loại trừ
được bệnh
Tiêu chuẩn chất lượng mẫu bệnh phẩm

Đúng thời điểm
3 ngày đầu của bệnh
 Trước khi dùng thuốc kháng virus




Đúng chủng loại
Đúng thao tác
Bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm
đúng cách
Chân thành cảm ơn