Die neuen „Blue Genes“ – gerichtete Klonierung

Eine andere Darstellung des Enzym/Substrat-Komplexes Mg

2+

Die Ligation

DNA Ligasen sind Enzyme, die in doppelsträngiger

DNA

die Bildung von Phosphodiester Bindungen zwischen einer freien 5'-Phosphatgruppe und einer freien 3'-Hydroxylgruppe zweier DNA-Fragmente katalysieren.

Substrat

E. coli

Ligase T4 Phagen Ligase

Einfluss der Temperatur

Bam

H I

Hin

d III pUCD Schneiden

Bam

H I

Hin

d III lineares Plasmid Transformation und Selektion

Bam

H I

LacZ Hin

d III Insert blau weiß pUCD

lacZ

Ligation

CH 2 OH OH H OH H O H H S CH CH CH 3 3 H OH IPTG (Isopropyl-thio  -D-galactosid) H N CH 2 OH OH H OH O H H H OH O H Cl Br 5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-b-D-galaktosid (X-Gal) b-Galaktosidase Br Cl OH Br N H Luftoxidation Cl O H N N H O Blauer Indigofarbstoff Cl Br

http://www.biologie.uni-erlangen.de

Aus: http://de.wikibooks.org

Quelle: http://de.wikipedia.org/wiki/Peptidoglycane

O CH NH 2 C NH O S CH 3 N CH 3 COOH Wirkung von Ampicillin  -Lactamring β-Lactam-Antibiotika (kurz β-Lactame) binden an das PBP (Penicillin-Binde-Protein oder auch Transpeptidase). Dieses Protein ist zuständig für das Entstehen der Peptidbindungen in der Zellwand. Wegen des Fehlens ausreichender Mengen PBP entstehen schon während des Bakterienwachstums Läsionen in der Zellwand, die Membran verliert demzufolge die Selektivität ihrer Permeabilität und kann die Zytoplasmakonzentration nicht mehr regulieren (die Nährstoffe werden 'verdünnt',). Nach gewisser Zeit wird das Bakterium lebensunfähig. Unter extremen Bedingungen (Labor) lassen sich regelrecht 'platzende' Bakterienzellen beobachten. β-Lactame wirken im Prinzip bakterizid. (aus Wikipedia

Die Elektrophorese

Zirkulär entspannt Supercoil

Montag 9.00

10.00

11.00

12.00

13.00

14.00

15.00

16.00

17.00

Einführung mit Pipettierübungen Praxis des Pipettieren Theorie und Praxis kompetente Zellen 8 x 4 Reaktionsgefäße Ansatz des Restriktionsverdaus 4 x 2 Aliqots (Roche/2) Mittagspause Inaktivieren des Verdaus Elektrophorese Kontrolle Ligase Transformation plus GFP Ausplattieren Ende Selektion Kontrolle !

Plasmide bereithalten

Dienstag 9.00

10.00

11.00

12.00

13.00

14.00

15.00

16.00

17.00

Gelgießen Platten anschauen Gel Beladen Auswertung Platten Ban II Verdau Anfärben Gel interpretieren (Supercoil, circulär entspannt) Entsorgung und Sicherheit Mittagspause Datenbankeinführung Contigs, Genom, EST, Human Chrom. Karte Blast Übung Struktur Helix vs. Faltblatt Diskussion Abschluss Evaluationsbögen