Transcript predavanje 1

Monoklonska antitela i
njihova primena
Istorijat razvoja monoklonskih antitela
•
1890 Von Behring i Kitasato otkrili da serum vakcinisanih osoba sadrži supstance
koje su nazvali antitela
•
1900 Ehrlich predložio“ side-chain” teoriju
•
1955 Jerne postavio postulate teorije prirodne selekcije, dok ju je Frank
Macfarlane Burnet razradio
•
U isto vreme, Porter je izolovao “fragment of antigen binding “ (Fab) i “fragment
crystalline” (Fc) iz globulina zeca
•
1964 Littlefield razvio način za izolaciju hibridnih ćelija iz 2 roditeljske ćelijske
linije upotrebom HAT selekcionog medijuma
•
1975 Kohler i Milstein uspostavili fuziju normalne i maligne ćelije. To je
rezultovalo dobijanjem prvih monoklonskih antitela za šta su 1984 godine dobili
Nobelovu nagradu
Struktura imunoglobulina-veza sa funkcijom
• Antigenski receptori na površini B ćelija
• Solubilna antitela
Imunoglobulini su bi-funkcionalni proteini
• vezivanje Ag
• vezivanje za Fc receptor ili za komplement vezujući
protein
Zašto je antitelima potreban Fc region?
(Fab)2 fragment može •
detektuje antigen
•
precipitira antigen
•
blokira aktivna mesta toksina ili molekula vezanih za patogene
•
blokira interakcije domaćina i molekula vezanih za patogene
ali ne može da aktivira
•
inflamatorne i efektorske funkcije povezane sa ćelijama
•
Inflamatorne i efektorske funkcije komplementa
•
unošenje antigena i njihovu obradu
Struktura različitih klasa antitela
Poliklonska vs Monoklonska antitela
Imunizovana životinja
7+ dana
3 dana
B limfociti
Imortalizacija
Serum
Purifikacija
antitela
Poliklonska
“hibridomi”
cDNA kloniranje
Monoklonska
ANTITELA
Poliklonska
Monoklonska
Produkuju ih:
mnogi klonovi B Ly
jedan klon B Ly
Vezuju se za:
Multiple epitop svih
imunizaciji
jedan epitop jednog antiegna
Klasa antitela:
Smeša različitih klasa
antitela (izotipovi)
sva su jedne iste klase antitela
Ag-binding mesta:
Smeša antitela sa različitim
Ag-binding mestima
sva imaju isto Ag-binding mesto
Potencijalna unakrsna
reaktivnosti:
Visoka
Nisu moćna sredstva za
kliničke dijagnostičke testove
Niska
Sigurna za kliničke
dijagnostičke testove
Produkcija monoklonskih antitela
• Ovaj metod uključuje
fuziju B ćelija sa
mijelomskim ćelijama
• Danas postoje dva široko
adaptirana metoda koja se
koriste za produkciju
monoklonskih At
• In vivo & in vitro
• Postoje prednosti i mane
za obe metode
• Produkcija ćelija koje
produkuju mAt se odvija
uobičajeno u miševima.
I korak: - Imunizacija miša i selekcija miševa
donora za stvaranje hibridnih ćelija
• Miševi se imunizuju antigenom u prisustvu adjuvansa. Antigen mogu biti cele
ćelije, fragmenti membrane ili kompleksni molekuli.
• Serumi miševa se skeniraju korišćenjem različitih tehnika kao što je npr ELISA.
• Kada je prisutan dovoljan titara antitela miševi se eutanizuju i izoluje se slezina
kao izvor ćelija za fuziju
ANTIGEN
(intaktne ćelije/
cele ćelijske
membrane/
mikroorganizmi) +
ADJUVANT
Titar antitela
raste u serumum
Izolovanje slezine
(izvor ćelija)
II korak: - Skrining miševa za produkciju antitela
Nakon
nekoliko
nedelja od
imunizacije
Određuje se titar antitela u serumu
(Tehnike: - ELISA / protočna citofluorimetrija)
Titar jako nizak
Visok titar
2 nedelje
BOOST
(čist antigen)
BOOST
(čist antigen)
III korak: - Priprema mijelomskih ćelija
• Mijelomske ćelije su imortalizovane ćelije koje mogu neprekidno da se
umnožavaju.
• Ove ćelije su tretirane 8-azaguaninom da bi se obezbedila osteljivost na HAT
Mijelomske ćelije
+ 8Azaguanine
Imortalizovan tumor limfocita
Mijelomske ćelije
HGPRT-
Visko vijabilitete & brz rast
IV korak: Fuzija mijelomskih ćelija sa splenocitima
imunizovanog miša
• Splenociti izolovani iz miša se fuzionišu sa mijelomskim ćelijama putem
kocentrifuzije u polietilen glikolu i potom se ćelije se zasade u HAT selekcioni
medijum
• hipoksantin-aminopterin-timidin (HAT) selekcioni medijum – aminoterin blokira
sintezu nukleotida i samo fuzionisane ćelije rastu u HAT medijum
• Ćelije se zasade za podlozi ćelija kostne srži miša da bi se promovisao rast
hibridoma
PEG
FUZIJA
SPLENOCITI
MIJELOMSKE
ĆELIJE
Kultivacija ćelija
u medijumu za
rast ćelija
HIBRIDNE ĆELIJE
V Korak: Kloniranje hibridnih ćelija
• Miševi se inokuliraju hibridomima i postaju fabrika za prudukovanje At
• Uzorkuje se ascitna tečnost iz miševa
VI korak: Specifičnost antietla se proveri i izvrši
se prečišćavanje
•
•
•
•
•
At se skeniraju korišćenjem vezivanja za specifične antigene
Prednost in vivo procesa
Relativno jeftin i lak postupak
Nedostatak:
Etičko pitanje korišćenja životinja.
• VII korak: željena At se kloniraju
• Ovaj postupak se izvodi in vitro u flaskovima za kultivaciju ćelija
Prečišćavanje antitela
Afinitetna hromatografija:
1.
Vezivanje antitela za matriks (npr sefarozni gel)
2.
dodaje se mešavina proteina – antigeni se vezuju za antitela na matriksu
3.
Ispiranje nevezanog materijala
4.
Nizak pH – antitela se oslobađaju od antigena – koja su sada oslobođena
kontaminacije
Primena monoklonskih antitela
 Primena u istraživanjima
Sve oblasti osnovnih i primenjenih bioloških
istraživanja
 Dijagnostička primena
Biosenzori & Microarrays
 Primena u terapiji i profilaksi
 Klinička primena
Purifikacija lekova, oslikavanje ciljeva
 Buduća primena
Borba protiv bioterorizma
Modifikacija monoklonskih antitela za
primenu u istraživanjima
Anti-mišje
Antitelo sa
vezanim markerom
fluorescentana boja
ili enzim
Mišje
Monoklonsko
Antitelo
Antigen
PRIMENA MONOKLONSKIH ANTITELA
in vitro
*
in vivo
*
*
DIJAGNOSTIKA
TERAPIJA
PROFILAKSA
katalitička
+ MAt
(Abzimi)
kriterijumi za registrovanje bioloških preparata:
sterilnost
apirogenost
netoksičnost
MONOKLONSKA ANTITELA U DIJAGNOSTICI I
*
identifikacija ćelijskih antigena
antitela prema citoskeletalnim proteinima
(citokeratini, vimentin, dezmin, neuralni fibrilarni antigen itd.)
antitela prema organ-specifičnim antigenima
(prostatično-specifični antigen, prostatična kisela fosfataza, humani
horiogonadotropin, alfa-fetoprotein i karcinoembrionalni antigen)
antitela u dijagnostici limfoproliferativnih oboljenja
(CD klasifikacija antigena ćelija imunog sistema)
*
identifikacija bakterijskih, virusnih i parazitnih antigena
*
identifikacija solubilnih antigena
(hormoni, enzimi, citokini i dr. biološki aktivne supstance)
MONOKLONSKA ANTITELA U DIJAGNOSTICI II
 MAt se koriste u dijagnostičkim kitovima za dijagnozu različitih
infektivnih bolesti, detekciju trudnoće, monitoring nivoa leka,
podudarnost HLA antigena, detekciju dijabetesa, kancera i u
imunoscintigrafiji
 FDA je odobrila dijagnostički marker koji može da utvrdi razmere
bolesti kod bolesnika sa dijagnozom sitnoćelijskog karcinoma pluća. S
obzirom da ovi agensi mogu da detektuju tumor u drugim delovima u
jednom trenutku, ona može da pomogne lekarima kod lečenja pacijenata
sa uznapredovalom formom bolesti bez daljih dijagnostičkih testova
 Novi molekul, Nofetumomab, je fragment monoklonskog antitela koji se
kada se označi radioizotopskom tehnikom može da detektuje antigene
koji se nalaze na površini većine ćelija sitnoćelijskog karcinoma pluća.
Test za dokazivanje trudnoće
MONOKLONSKA ANTITELA U TERAPIJI
• Konačno, snovi Paul Ehrlich koji je smatrao
antitela magičnim kuglicama su postali
stvarnost.
• Ispostavilo se da su monoklonska antitela
najvažnija klasa lekova u onkologiji i to sa
veoma brzim širenjem spektra delovanja.
Paul Ehrlich
(1854-1915)
Problemi sa upotrebom mišjih mAt u terapiji
• Terapeutska upotreba glodarskih mAt kod ljudi je limitirana zbog
 njihove imunogenosti
 kratkog poluživota u cirkulaciji
 nesposobnosti efikasnog započinjanja efektroskih mehanizama
kod ljudi
• Ovo je zbog razlika između miša i čoveka
• Teške alergijske rekacije kod ljudi kada se mišja mAt unesu u
organizam pacijenta
• Konstantni region mišjih mAt su neefikasna u interakciji sa humanim
efektorskim molekulima.
Evolucija terapeutskih antitela
A. Mišja mAbs: mAt sa odličnim afinitetom i specifičnošću, napravljena
upotrebom konvencionalne tehnologije hibridoma. Klinička efiksnost je
kompromitovana zbog HAMA (Human Anti Murine Antibody) reakcije,
koja vodi alergijskoj ili imunskim kompleksima posredovanoj
preosetljivosti.
B. Himerična mAt: kombinovanje humanih konstantnih regiona sa intaktnim
glodarskim varijabilnim regionima. Afinitet i specifičnost nepromenjena.
Takođe, uzrokuje se HAMA reakcija (30% mišji izvor)
C. Humanizirana mAt: sadrži samo CDR regione glodarskog varijabalnog
regiona ubačene u humani varijabilni region
1. TRANSGENIC
DNA SPLICING /
GENE KNOCK OUT
2. LIBRARIES
a.BACTERIOPHAGE
b. mRNA
c. Cell Surface
Nomenklatura terapeutskih antitela
• Nastavak u imenu – momab za mišja antitela
- ximab za himerična antitela
– zumab za humanizirana antitela
- umab za humana antitela
Mehanizmi delovanja terapeutski antitela
Terapeutski efekti monoklonskih antitela
Direktni efekti
iranje faktora rasta / njihovih receptora
kcija apoptoze
cija angiogeneze
Indirektni efekti
Komplement-zavisna citotoksičnost (CDC)
telima posredovana ćelijska citotoksičnost (ADCC)
Sistemi za isporuku toksina, radionuklida i citostatika
Stvaranje anti-idiotipskih antitela
Ciljanje efektorskih ćelija upotrebom bispecifičnih antitela
Strategije za terapeutsku primenu
monoklonskih antitela
in vivo:
mAt specifična za diferencijacione antigene (ADCC, fiksacija komplementa)
mAt sa direktnim anti-proliferativnim efektom (receptori za faktore rasta,
apoptoza)
mAt koja interferiraju sa angiogenezom
mAt kao nosači za radioizotope (radioimunoterapija)
mAt kao nosači za toksine (imunotoksini)
Anti-idiotipska mAt
Bispecifična mAt usmerena na efektorsku aktivnost ćelije
ex vivo:
Autologe transplantacije kostne srži: prečišćevanje autografta primenom mAt
Alogene transplantacije kostne srži: prevencija GVHD deplecijom T ćelija
MONOKLONSKA ANTITELA
KONJUGACIJA
citostatici
*
doksorubicin, idarubicin, bleomicin, citozin-arabinozid,
cisplatinijum,hlorambucil, mitomicin C (sve vrste tumora)
toksini
*ricin, abrin, gelonim, difterični toksin, egzotoksin
Pseudomonas-a (tumori dojke, ovarijuma, kolorektalnog
karcinoma, melanoma ili B limfoma)
*
radionuklidi
*
antibiotici
131J, 123J, 111In, 99mTc
(ovarijalni i kolorektalni karcinomi,
melanomi, neuroblastomi, B-ćelijski limfomi, hepatomi)
Višestruka upotreba konjugovanih
monoklonskih antitela
Antitela mogu da isporučuju lekove
do specifičnih ciljeva
MONOKLONSKA ANTITELA U TERAPIJI
*
anti-tumorski agensi
-u terapiji nekih vrsta tumora pluća, malignih melanoma, neuroblastoma,
adenokarcinoma kolona, Tćelijskih leukemija i limfoma i ne-Hodgkinovih
limfoma
- mAt na karcinoembrionalni antigen konjugovan sa 131J u terapiji
adenokarcinoma kolona ili anti-feritin 131J mAt u tretmanu intrahepatičnih
neoplazmi.
*
imunosupresivni agensi
*
anti-toksinski agensi
- u lečenju autoimunih bolesti
- u transplantaciji tkiva i organa
- u lečenju septičkog šoka i respiratornog distres sindroma
- u neutralizaciji toksina bakterija, gljiva, bojnih otrova ili toksičnih efekata
lekova ili njihovih metabolita.
*
kontraceptivna sredstva
Prvi rad o primeni monoklonksih antitela
u lečenju pacijenta sa tumorom
Monoklonska antitela u terapiji tumora
Tri mehanizma mogu da budu odgovorna za lečenje kancera
A.
mAt deluju direktno kada se vezuju za specifične antigene i
indukuju imunski odgovor protiv tumorskih ćelija. Tako što indukuju
apoptozu tumorskih ćelija, inhibiraju njihov rast ili interferiraju sa
ključnom funkcijom.
B.
mAt su modifikovana za isporuku toksina, radioizotopa, citokina ili
drugih aktivnih konjugata.
C.
Moguće je dizajnirati i bispecifična antitela koja mogu da se vežu
njihovim Fab regionima za ciljni antigen i za konjugat ili efektorsku ćeliju.
Monoklonska antitela u terapiji karcinoma
ADEPT, antibody directed enzyme prodrug therapy;
ADCC, antibody dependent cell-mediated cytotoxicity;
CDC, complement dependent cytotoxicity;
Primena u terapiji transplantacije
•
Popravljen ishod transplanatcije kostne srži upotrebom CD52 mAt koje spečava
bolest graft-Versus-domaćin (GVHD) i odbacivanje grafta. GVHD je najveći
uzrok mortaliteta i mobiditeta posle transplantacije alogene kostne srži ali se
može sprečiti uklanjanjem T Ly i kostne srži donora.
•
Međutim, deplecija T ly povećava rizik od odbacivanja grafta. Studije su
pokazale da upotreba CD52 mAt u eliminaciji T Ly i iz koste srži donora i
recipijenta sprečava GVHD i odbacivanje grafta
•
Alemtuzumab je monoklonsko antitelo koje se koristi u ovu svrhu.
MONOKLONSKA ANTITELA U PROFILAKSI
aktivna imunizacija
- imunosistemu domaćina se prezentira prikladan antigenski stimulus
pasivna imunizacija
-unošenje gotovog imunoreaktivnog seruma
-unošenje purifikovanih antitela
-transfer gotovih limfoidnih ćelija iz imunizovanog
donora (adoptivna imunizacija)
monoklonska antitela
- izvanredna specifičnost
- standardizovanost agenasa
- mogućnost modifikacije (odstranjivanje
Fc fragmenta, konjugacija sa toksinima)
Katalitička monoklonska antitela
(Abzymes)
 To su monoklonksa antitela sa katalitičkom aktivnošću.
 Najčešće su veštački konstruisana ali su takođe detektovana i kod zdravih
osoba (anti-vazoaktivni intestinalni peptid autoantitela) i u pacijenata sa
autoimunskim bolestima kao što je SLE gde se ona mogu vezati za DNK i
hidrolizovati je.
 Antitela su izuzetno efikasna u vezivanju za osnovno stanje ciljnih molekula
dok enzimi dobijaju njihovu katalitičku aktivnost nakon čvrstog vezivanja za
prelazno stanje u reakciji.
 Tako antitela mogu da budu efikasni katalizatori ako se naprave za reakciju
prelaznog stanja.
 Lemer i njegovi saradnici su otkrili verovatnoću delovanja antitela kao
enzima stvaranjem hapten nosač kompleksa gde hapten strukturno liči na
prelazno stanje a anti-hapten antitela generišu katalitičku aktivnost.
 Hidroliza supstrata se povećava hiljadu puta nakon inkubacije.