Transcript Sperm morfolojisi değerlendirmesi

Sperm morfoloji değerlendirmesi
Doç. Dr. Türkan Yiğitbaşı
İstanbul Medipol Üniversitesi
Biyokimya Anabilim Dalı, 2014
TKBD-Semen Analizi Kursu
Sunum Planı
Giriş
Sperm morfolojisinin tanısal önemi
Boyama yöntemleri
Değerlendirme
Örnek slaytlar
Sperm morfolojisi
• Leeuwenhoek;1677
Sperm ile ilgili ilk çizimsel tanımlama
• MacLeod J;1952
İlk kez normal sperm morfolojisini tanımladı.
• Freund M;1966
Normal ve anormal sperm morfolojisi farklılıklarını
tanımladı.
• Eliasson R;1971
Sperm boyutlarının spesifik ölçümlerini verdi.
Sperm morfolojisi
• Kruger TF; 1986
Sperm morfolojisinin fertilitedeki prognostik değeri
üzerine ilk yorumları yaptılar.
• Kruger TF;1987
Bilinen sperm morfoloji kriterleri üzerine yeni kriterler
eklediler.
• Kruger; 1988
Sperm morfolojisinin IVF başarısı üzerindeki etkilerini
yayınladılar.
5
Normal sperm morfolojisi fertilizasyon oranı için
mükemmel bir belirleyicidir.
Normal morfolojili sperm oranı
IVF de gebelik oranı ile
ilişkilidir 1.
Baş defekti olan spermler,
normal olanlara göre hareketsiz
olma veya daha yavaş hareket
etme eğilimindedirler 2
1Kruger et al, 1996; Morgenthaler
1995 2Aitken et al, 1995;
et al,
Fertil Steril 1999;72:124-128.
6
Normal morfoloji
<%4
%4-14
>%14
Fertilizasyon oranı
%7.6
%63.9
%88,3
IVF’de sperm morfolojisinin
prediktif değeri
Fertilizasyon Oranı
Normal Form < % 14 Normal Form > % 14
Oosit Başına %
% 49.4
% 88.3
Klivaj Oranı
% 47.5
% 87.0
%
Kruger et al; 1996
• %0-20 sperm oranında zayıf fertilizasyon gösteren
olguların %75’inde tek veya çogul sperm defekti vardır
Liu & Baker;1994
Sperm boyama yöntemleri
Boyama yöntemi olarak
• Papanicolaou
• Shorr
• Diff-Quick
• SpermMac
bilinen yöntemlerdir.
Yaymanın hazırlanması
• Semen numunesi karıştırılır.
• Numunedeki sperm konsantrasyonuna göre 5-10
µl numune lam üzerine alınır.45 derecelik açı ile
en az iki yayma yapılır.
• Yayma,havada 20 dakika kurutulur ve boyanır.
Diff-Quick boyama yöntemi
1- Numunenin yayılıp kurutulduğu lam, koplin jar içindeki
fiksatifte (Metil alkol içinde Tri-methane boyası) 15 sn
tutulur.
2-Solüsyon 1 (Xanthene Dye) içinde 10 sn tutulur.
3-Solüsyon 2 (Azine A ve Methylene Blue) içinde 5 sn
tutulur.
4-Preparat çeşme suyu
ile yıkanır.
Papanicolaou yöntemi
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Immerse slides in 95% (v/v) ethanol for at least 15 minutes.
Sequentially immerse the slides in:
1. Ethanol 80% (v/v) 30 seconds
2. Ethanol 50% (v/v) 30 seconds
3. Purified water 30 seconds
4. Harris’s haematoxylin 4
minutes
5. Purified water 30 seconds
6. Acidic ethanol 4–8 dips*
7. Running cold tap water 5
minutes
8. Ethanol 50% (v/v) 30 seconds
9. Ethanol 80% (v/v) 30 seconds
• 10. Ethanol 95% (v/v) At least 15
minutes
• 11. G-6 orange stain 1 minute
• 12. Ethanol 95% (v/v) 30 seconds
• 13. Ethanol 95% (v/v) 30 seconds
• 14. Ethanol 95% (v/v) 30 seconds
• 15. EA-50 green stain 1 minute
• 16. Ethanol 95% (v/v) 30 seconds
• 17. Ethanol 95% (v/v) 30 seconds
• 18. Ethanol 100% 15 seconds
• 19. Ethanol 100% 15 seconds
Spermac boyama yöntemi
1-Fiksatifte preparat 15 dk tutulur.
2-8-10 kez suya batırılır yıkanır ve lam ucundan kurutma
kağıdına bastırılarak suyu alınır.
3-A solüsyonunda 90 saniye tutulur.
4-Yıkama tekrarlanır.
5-B solüsyonunda 90 saniye tutulur.
6-Yıkama tekrarlanır.
7-C solüsyonunda 90 saniye beklenir.
8-Yıkama tekrarlanır.
Boyama yöntemlerinin
karşılaştırılması
• Papanicolau
boyama kalitesi daha yüksektir
ucuzdur
• Diff Quik
hızlıdır
spermler küçülmezler
zemin fazla boya alır
Yaymanın değerlendirilmesi
• Kuruduktan sonra Değerlendirme immersiyon
yağı ve objektifi ile 100X büyütmede yapılır.
• Numunede en az 200 boyanmış sperm sayılır.
Baş,boyun ve kuyruktaki şekil değişiklikleri
Kruger Strict morfoloji kriterlerine göre
sınıflandırılır.
Yaymanın değerlendirilmesi
Normal, baş, mid-piece ve kuyruk anomalileri
olmak üzere rapor edilir.%4 ve üstü normal
olarak kabul edilir.
Sperm boyut ve şekillerindeki geniş
varyasyonlardan dolayı değerlendirme
subjektiftir.
Kruger Strict morfoloji kriterleri
• Normal sperm için baş oval ve
düzgün olmalı,akrozom başın %4070’ini kapsamalıdır.
• Boyun,mid-piece ve kuyrukta
anomali olmamalıdır.
• Stoplazmik droplet baş boyutunun
yarısından fazla olmamalıdır.
Normal spermin boyutları
Baş anomalileri
•
•
•
•
•
•
Şekil değişiklikleri
Boyut değişiklikleri
Vakuoller
Akrozom azlığı
Akrozom yokluğu
Çift başlı
19
Baş anomalileri
Normal
Sitoplazmik
Droplet
İnkomplet Spermatid
Seperasyonu
Duplikasyon
20
Baş anomalileri
Normal
Nükleus
Vakuolü
Büyük
Nükleus
Küçük
Nükleus
21
Baş anomalileri
Normal
Piriform
Yuvarlak
Baş
Elonge
Baş
Diadem
Defekti
Mid-Piece anomalileri
•
•
•
•
•
•
Düzensiz şekil
Bükülmüş
İnce
Kalın
Bükülmüş kuyruk bağlantısı
Kuyruksuz baş
23
Mid-Piece anomalileri
Normal
Sitoplazmik
Droplet
Kinked
Mid-piece
Bend
Mid-piece
24
Mid-Piece anomalileri
Normal
Mitokondrial Mitokondrial
Komplet
Segmental
Aplazi
Aplazi
Pseudodroplet
Kopuk
Baş
Kuyruk anomalileri
•
•
•
•
•
Birden fazla
Kangal şeklinde
Kırılmış
Kısa
Terminal droplet
26
Kuyruk anomalileri
Dag
Defekti
Coiled
Tail
Duplikasyon
27
Amorf sperm formları
Normal
Multipl
Anomali
Sınıflandırılamayan
Form
İnkomplet
Seperasyon
(Adezyon)
28
İmmatür sperm formları
İmmatür Germ Hücreleri
Prekürsör Hücreler (Spermatid)
Örnekler
Örnekler
31
32
33
34
35
36
Teşekkür ederim…