Semen analizinde standart ve isteğe bağlı test prosedürleri

Doç. Dr. Türkan Yiğitbaşı İstanbul Medipol Üniversitesi Biyokimya Anabilim Dalı, 2014 TKBD-Semen Analizi Kursu

Sunum Planı

 WHO 2010’da belirlenen standart test prosedürleri İsteğe bağlı test prosedürleri  Testlerle ilgili genel bilgiler  WHO 2010’göre ve uygulanan pratiğe göre test protokolleri

Standart test prosedürleri

 Semen'in makroskobik,mikroskobik incelenmesi  Spermin sayı,motilite,morfolojik incelenmesi  Sperm vitalite testleri  Semende lökosit ve immatür germ hücresi tayin (peroksidaz boyama)  Antisperm antikor testleri

Vitalite testleri

• • Hareketsiz spermin canlı olup olmadığı saptanır.Bu testler hücrelerin membran bütünlüğü prensibine dayanmaktadır. Ölü hücrelerde hasarlanan plazma membranı boyayı alır.

Tüm numunelerde yapılabilir ancak ileri hareketli sperm oranı %40’ın altında vitalite testleri özellikle önerilir.Alt referans limit %58’dir.

Vitalite değerlendirme

Eosin-nigrosin Ölü sperm pembe/kırmızı boyanır Eosin (1%) Ölü sperm pembe/kırmızı boyanır Trypan (0.4%) blue Ölü sperm mavi boyanır.

TKBD-Semen Analizi Kursu 5 Bu üç test tanı amaçlı kullanılır. Genellikle semen ve boya 1:1 oranında karıştırılır. Slayta yayılır. 40’lık objektif ile 200 sperm sayılarak değerlendirme yapılır.

Hypo-osmotic Swelling Test

   Canlı fakat hareketsiz spermin intrastoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) için seçiminde kullanılan bir testtir 1 .

Özellikler testiküler biyopsi ile elde edilen sperm değerlendirilir.

Na-sitrat ve fruktozun konsantre solüsyonlarına daldırılan sperm kuyruklarındaki kıvrılma spermin canlı olduğunu gösterir.

1 Lin et al, 1998; Cayan et al, 2001

HOS testinin yapılışı

• HOS solüsyonu hazırlanır (0.735 g Sodyum sitrat, 1.351 g D-fruktoz 100 ml distile suda çözülür) veya ticari solüsyon olarak temin edilir.

• 1ml HOS solusyonu üzerine 100 µl semen ilave edilir.Karıştırılır. 37 °C’de 5-30 dakika beklenir.

• Karışımın 10 µl ‘si lam üzerine alınır. 22 mm × 22 mm lamel ile kapatılıp ×40 büyütmede faz kontras mikroskobunda 200 hücre incelenir.

Hypo-osmotic Swelling Test

Canlı spermin kuyruğu kıvrılır.

Lökosit

 Erkek üreme sisteminde infeksiyon/inflamasyon İnfertil hastaların % 10-20’sinde gösterilmiş.

 Semende artmış lökosit sayısı(Lökospermi,piyospermi)infeksiyon ve azalmış sperm kalitesi ile ilişkilidir.

 Semende lökosit varlığı reaktif oksijen radikalleri (ROS) üretimine neden olan başlıca kaynaktır 1 . Bu nedenle sperm motilitesini ve DNA integritisini bozabilir.

1 Kessopoulou, J Reprod Fertil, 1992

Lökosit

• • • Semende lökositler başlangıç testi (Peroksidaz aktivitesinin ölçülmesi) ve daha gelişmiş (immunositokimyasal )yöntemlerle gösterilebilir.

Bu yöntemlerle immatür germ hücresi ve lökosit ayrımı yapılır.

Normal: <1 milyon/ml

Peroksidaz aktivitesi:

• • • • Peroksidaz pozitif granülositler, semendeki baskın lökosit formudurlar.

Semende peroksidaz aktivitesinin rutin olarak ölçülmesi başlangıç tarama tekniği olarak kullanılır.

Basit ve ucuzdur.

Ancak peroksidaz içermeyen lenfosit, makrofaj ve monositlerin tanısını yapamaz.

Wolff, 1995; Johanisson et al., 2000

LeucoScreen

Diaminobenzidin + H 2 O 2 Peroksidaz okside diaminobenzidin (kahverengi pigment)

Numune Pozitif kontrol Negatif kontrol

Yuvarlak hücre Granülosit Semen Peroksidaz 20 μl Distile su Fiksatif Numune karışımından 10 μl alınır.

Mikroskopta x40 büyütmede incelenir.

Substrat 60 μl 20 μl 20 μl 1 damla 1 damla 1 damla 60 μl 60 μl

Leucoscreen testinin değerlendirilmesi

• Granulocytes/ml = Sperm Count X Number of brown cells Number of sperm • • • • Sperm Count = 73 X 10 6 cells/ml Number of brown cells = 4 Number of sperm = 66 Applying the formula: 73 x 10 6 granulocytes/ml X 4/66 = ~4 x 10 6

Lökosit ölçüm yöntemi(Monoclonal Antibody technique)  Spermler phosphate buffered salin yıkanır ve slayta yayılır.

(PBS) içinde  İmmun-histolojik boyama protokolü uygulanır.

L.Murthy

Anti-sperm Antikorlar (ASA)

    ASA’lar sperm proteinlerine cevap olarak üretilir ve spermi fertilizasyon için yetersiz hale getirir.

ASA’lar direkt olarak spermde, indirekt olarak seminal plazma’da ve serumda ölçülebilir.

Immunobead testi ve MAR testi direkt ölçüm için kullanılan iki testtir.Sonuçları her zaman birbiri ile uyumlu olmayabilir.

Immunobead testi için yıkanmış sperm,MAR testi için semen kullanılır.

Immunobead Test (IMB) Prosedürü

   Donör spermi, hastadan alınan seminal sıvı ile inkübe edilir. Sperm birkaç kez yıkanır ve IgG ve IgA kaplı boncuklar ile inkübe edilir.

Mikroskop altında boncuklara bağlanmış spermler sayılarak, yüzdesi hesaplanır.

IMB

IMB

   

MAR Testi

Mixed Anti-globulin Reaction TKBD-Semen Analizi Kursu 10 µl semen, SpermMar lateks partikülleri ve antiserum lam üzerine pipetlenir.

Semen ve lateks partikülleri 5 saniye karıştırılır arkasından antiserum ile 5 saniye karıştırılır.

Lam, lamel ile kapatılır.Oda ısısında,içine nemli pamuk yerleştirilmiş petri dish’de 2-3 dakika bekletilir.

200 sperm sayılır.Boncuklara bağlanmış sperm yüzdesi % 50’den daha fazla ise anormal kabul edilir.

20 Lateks partikülleri antiserum semen

Semen analizinde isteğe bağlı test prosedürleri

 Semende lökosit ve immatür germ hücresi tayin (immunokimyasal boyama)  Multiple sperm defekt indeksleri  Sperm ve servikal mukus etkileşimi (post koital test)  Biyokimyasal ölçümler (Fruktoz, çinko,nötral α-glukozidaz)  Bilgisayar destekli semen analizi(CASA sistemleri)

Multiple sperm defekt indeksleri  Morfolojik olarak anormal sperm,çoğunlukla birden fazla defekt içerir (baş, mid-piece, kuyruk, rezidüel stoplazma).

 Spermdeki morfolojik anomalilerin detaylı ölçümü,basit olarak normal sperm yüzdesini vermekten daha faydalı olabilir.

 Bu indeksler fertilite ile ilişkili bulunmuştur.

Multiple sperm defekt indeksleri • • • • • • MAI:the multiple anomalies index (Jouannet et al., 1988); TZI: the teratozoospermia index (Menkveld & Kruger, 1996; Menkveld et al., 2001); SDI:the sperm deformity index (Aziz et al., 1996, 2004).

Multiple sperm defekt indeksleri nasıl hesaplanır?

Multiple sperm defekt indeksleri nasıl değerlendirilir?

Postkoital test

• • Servikal mukus, siklus ortasında östrojen etkisi ile sperm penetrasyonuna uygun hale gelir.Bu durum kadından kadına ve her siklus için değişiklik gösterebilir.

Post koital testin amacı servikal mukustaki aktif sperm sayısını belirlemek ve canlılığını değerlendirmektir (Sobrero & MacLeod, 1962).

Postkoital testin yapılışı

• • • • • Test ovulasyon zamanında yapılmalıdır.

Laboratuvar tarafından servikal mukusun değerlendirilmesi koitustan sonraki 9 ile 14.saat ler arasında yapılmalıdır.

İğnesiz tüberkülin şırıngası ile posterior vaginal fornix ten olabildiği kadar seminal sıvı alınır.

Farklı bir kateter ile endoservikal kanaldan alınan seminal sıvı lam üzerine alınır.Üzerine lamel (22 mm × 22 mm) kapatılır.

×4o büyütmede faz kontrast mikroskobunda incelenir.

Postkoital testin değerlendirilmesi

• • • • Mukusta sperm bulunmazsa test negatiftir.

Endoservikal mukusta progressif motil sperm bulunması, servikal etkenlere karşı ve kadın ve erkekteki otoimmuniteye karşı savunma mekanizmalarının geliştiğini gösterir.

Non-progressif motil spermin bulunması servikal mukus veya sperme ait antikorların varlığını gösterebilir.

Başlangıç testi negatif veya abnormal ise test tekrarlanmalıdır.

Biyokimyasal ölçümler

• • Zayıf semen kalitesi ,abnormal spermin testiküler üretiminden ya da spermin epididimde post-testiküler hasarından ya da anormal aksesuar bez sekresyonlarından kaynaklanabilir.

Bu aksesuar bezlerin sekresyonları, aksesuar bez fonksiyonlarını gösterebilir.

Epididim   -Glukozidaz  L-Karnitin Seminal vezikül  Fruktoz, PG Prostat Prostat  Asit fosfataz  Sitrik asit  Çinko  γ-glutamil transpeptidaz

Biyokimyasal ölçümler

 Fruktoz  Çinko   -Glukozidaz  Asit fosfataz  Sitrik asit Yukarıdaki tüm biyokimyasal ölçümler için ticari, spektrofotometrik kitler mevcuttur.

Fruktoz ölçümü

 Seminal vesikül’ün sekresyon kapasitesini gösterir.

 Sperm motilitesinin sağlanmasında enerji kaynağı olarak rolü vardır.

 Vesikula seminalislerin fonksiyonel, ejakülatuar duktusların açık olduğunu gösterir.

 Fizyolojik değer:150-600 mg/dl

CASA sistemleri (Computer assisted semen analysis system)

• CASA sistemleri için çeşitli üreticiler mevcuttur.

• • • CASA sistemleri sperm motilitesi ve kinematiği konusunda yeterlidirler.

Bazıları sperm konsantrasyonunu değerlendirebilir.

Birkaç tanesinin yarı otomatik morfoloji modülleri vardır.

CASA sistemleri (Computer assisted semen analysis system)

• • CASA sistemleri spermin kinetik parametreleri hakkında yüksek hassasiyete sahiptir,kantitatif ve kayıt edilebilir veri sağlar.

Bazı çalışmalar CASA sistemleri ile ölçülen, progresif motil spermin hareket özellikleri ve konsantrasyonu ile fertilizasyon oranını ilişkili bulmuşlardır.

CASA sistemleri (Computer-assisted semen analysis system)

CASA sistemleri (Computer assisted semen analysis system)

• Farklı CASA sistemleri, spermin hareketindeki varyasyonları tespit etmek için değişik matematik algoritmalar kullanmaktadır.

• Bu nedenle CASA sistemlerinin ölçümlerin karşılaştırılması açısından standardizasyonu yapılmamıştır.

CASA sistemleri (Computer assisted semen analysis system)

 CASA sistemlerinin erkek fertilitesini değerlendirme ve prognozu belirlemede, geleneksel semen analizine bariz üstünlüğü yoktur 1 .  Kullanılan sistemlerin özellikleri gelişmişse de günümüzde fertiliteyi belirlemedeki rolü henüz araştırma safhasında kabul edilmesi ve rutin kullanılması tartışılmaktadır 2 . 1 Krause W, 1995; 2 Samplaski. 2010

TKBD-Semen Analizi Kursu Teşekkür ederim… 39