Transcript Modern Instrumental Analysis

Modern
Instrumental Analysis
分离分析法导论
Introduction to
Chromatography
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色谱法概述
■色谱法(Chromatography)溯源
–100多年前俄国植物学家Tswett(茨维特)分离植物色素时采用
的实验方法
–他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,
再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成
各种不同颜色的谱带
–Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方
法，即现在的Chromatography(色谱法)
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Tswett色素分离实验
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A
■A
■B
■C
B
C
一根长玻璃管填充碳酸钙的颗粒
将碾碎之植物叶片的提取液灌入柱中
随着石油醚提取液向下流过柱子，现出展宽的色带
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色谱法与诺贝尔奖的关系
■ 1938年
R．库恩 (Riehard Kuhn，1900—1967) 德国人，利用Tswett
的方法研究类胡萝卜素和维生素
■ 1952年
马丁 (Arcger Martin，1910—) 英国人
辛格 (Richard Synge，1914—) 英国人，发明分配色谱法
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色谱法与诺贝尔奖的关系
年代
获奖学科
1937
化学
类胡萝卜素化学，维生素A和B
1938
化学
类胡萝卜素化学
1939
化学
聚甲烯和高萜烯化学
1950
生理学、医学
1951
化学
超铀元素的发现
1955
化学
脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素
1958
化学
胰岛素的结构
1961
化学
光合作用时发生的化学反应的确认
1970
生理学、医学
1970
化学
糖核苷酸的发现及其在生物合成碳水化合物
中的作用
1972
化学
核糖核酸化学酶结构的研究
1972
生理学、医学
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获奖研究工作
性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离
关于神经元触处迁移物质的研究
抗体结构的研究
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色谱法特点
■效率高。上百种性质类似的化合物可在同一色谱柱上得到分离，
复杂样品分析。
■速度快。几分钟至几十分钟完成复杂样品的分析。
■灵敏度高。直接检测纳克级，预浓缩可达皮克级。
■用量少。一次分析只需数纳升至数微升的溶液样品。
■选择性好。选择分离模式和检测方法，只分析感兴趣的部分。
■同时分析。短时间内可以实现几十种成分的同时分离与定量。
■易于自动化。从进样到数据处理的全自动化操作。
■定性能力较差。已经发展色谱法与其他分析技术联用。
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色谱法原理
■色谱法的原理
–是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解,分配,吸附等
化学作用性能的差异,当两相作相对运动时,使各组分在两相
中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离
–两相中有一相是固定的,叫作固定相(Stationary Phase),
有一相是流动的,称为流动相(Mobile Phase),流动相又叫洗
脱剂,溶剂
■相(Phase):
–物理化学术语,特指在某一系统中,具有相同成分及相同物
理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分的界面
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色谱法的分类（1）
■按流动相的物态分:
–气相色谱(Gas Chromatography, GC)
用气体作为流动相(又叫载气)
–液相色谱(Liquid Chromatography, LC)
用液体作为流动相(又叫洗脱剂)
■按操作形式分:
–平面色谱
纸色谱
薄层色谱
–柱色谱
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色谱法的分类（2）
■按分离原理分类:
–吸附色谱(Absorption Chromatography)
根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离
–分配色谱(Partition Chromatography)
分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同
–离子交换色谱(Ion ExchangeChromatography)
根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱(IC)
–体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography)
GPC(Gel PermeationChromatography)
–固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂
GFC(Gel Filtration Chromatography)
–固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液
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色谱图及色谱常用术语
■色谱图(Chromatogram):
色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲
线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间
色谱峰
1
2
3
4
时间
1. 对羟基苯甲酸甲酯；2. 对羟基苯甲酸乙酯；
3. 对羟基苯甲酸丙酯； 4. 对羟基苯甲酸丁酯
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峰高
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基线、色谱峰、峰高
基线是在正常实验操作条件下，没有组分流出，仅有流
动相通过检测器时，检测器所产生的响应值。稳定的基
线是一条直线，若基线下斜或上斜，称为漂移，基线的
上下波动，称为噪音。
漂移
噪音
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色谱峰的面积
峰面积
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色谱峰的宽度
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色谱峰的宽度
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色谱保留值
死时间t0：不被固定相滞留的组分，从进样到出峰最大所需的时间。
保留时间tR：组分从进样到出峰最大之所需的时间。
死体积V0：不被固定相滞留的组分，从进样到出峰最大之所需的
流动相的体积。
保留体积VR：组分从进样到出峰最大之所需的流动相的体积。
调整保留时间tR’
调整保留体积VR’
tR’=tR-t0
VR’=VR-V0
VR=tR×F
F-流动相流动速度 （ml.min-1)
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相对保留值
■相对保留值
在相同的操作条件下，一组分相对另一组分的调整保留
值之比
 2,1 
t
t
'
R ( 2)
'
R (1)

V
'
R ( 2)
'
R (1)
V
相对保留值仅与柱温、固定相性质有关，在同一类色谱柱上
具有比较好的重现性，是较好的定性指标。
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相对保留值计算
 2,1 
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t
'
R ( 2)
'
R (1)
t
2  0 .5

3
1  0 .5
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分配平衡
■在分配色谱中，组分的色谱行为与其在固定相与流动相
之间的分配行为密切相关
组分在两相之间达到分配平衡时，该组分在两相中的浓度
之比是一个常数，这一常数称为分配系数，用K 表示。
组分在固定相中的浓度 Cs
K

组分在流动相中的浓度 Cm
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保留时间与分配系数的关系
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分配比
■组分在两相中物质的量之比称为分配比:
csVs
Vs
组分在固定相中的物质的量 ns
k' 


K
组分在流动相中的物质的量 nm cmVm
Vm
不能被固定相保留的组分k’=0
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分配比与保留值的关系
由于分配过程发生在固定相与流动相之间，故分配比可用
保留时间或保留体积来表示：
t ' R t R  t0
k'

t0
t0
V 'R VR  V0
k' 

V0
V0
■分配比k’又称为容量因子、容量比或分配容量
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塔板理论
1941年马丁（Martin）和欣革（Synge）最早提出
塔板理论，将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱
柱设想成由许多小段组成。在每一小段内，一部分空
间为固定相占据，另一部分空间充满流动相。组分随
流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。并假定
在每一小段内组分可以很快地在两相中达到分配平衡，
这样一个小段称作一个理论塔板，一个理论塔板的长
度称为理论塔板高度H。
经过多次分配平衡，分配系数小的组分，先离开蒸
馏塔，分配系数大的组分后离开蒸馏塔。由于色谱柱
内的塔板数相当多，因此即使组分分配系数只有微小
差异，仍然可以获得好的分离效果。
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塔板数的计算
tR 2
tR 2
n  5.54(
)  16( )
Y1/ 2
Y
n有效
t 'R 2
t 'R 2
 5.54(
)  16( )
Y1/ 2
Y
H 有效 
L
n有效
n 塔板数 Y 色谱峰宽度 L 色谱柱长度 H塔板高度
■塔板理论只考虑了热力学因素，没有考虑动力学因素，应用
受到较大局限。
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速率理论-Van Deemter方程
速率理论是荷兰学者范·弟姆特于1956年提出的, 表述了影
响柱效的因素及提高柱效的多种途径，其核心是速率方程
（也称范·弟姆特方程式）。
H = A + B/u + c·u
H：理论塔板高度；u：载气的线速度(cm/s)
A─涡流扩散项
B/u—分子扩散项
c · u─传质阻力项
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H = A + B/u + c·u
■ A─涡流扩散项
A = 2λdp
dp：固定相的平均颗粒直径；λ：固定相的填充不均匀因子。
讨论：
固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。表现在
涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。空心毛
细管柱A=0
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■ B/u—分子扩散项
H = A + B/u + c·u
B  2D
D为组分在流动相中的扩散系数，单位是cm2s-1。
 弯曲因子，填充柱色谱  <1，空心毛细管柱则  为1.
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■c
H = A + B/u + c·u
· u──传质阻力项
C包括流动相传质阻力
系数Cm和固定相传质阻
力系数Cs
Cm为组分从流动相移向固定相时所受到阻力：
2
dp
2
0.01k '
Cm 

2
(1  k ' ) Dg
Cs组分从固定相移向流动相时所受到阻力：
d 2f
2k '
Cs 

2
3(1  k ' ) Ds
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速率理论的讨论
将涡流扩散项、分子扩散项及传质阻力项分别代入Van
Deemter方程，得到
2
2
2
d
d
0.01k '
2k '
p
f
H  2d p  2Dg / u  [



]u
2
2
(1  k ' ) Dg 3(1  k ' ) Ds
■涡流扩散、分子扩散及传质阻力是造成色谱峰扩展柱效下降
的主要原因。
■通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流
速可提高柱效。
■速率理论为色谱分离和操作条件的选择提供了理论指导。阐
明了流速和柱温对柱效及分离的影响。
■各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减
小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下
降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选
择最佳条件，才能使柱效达到最高。
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柱效与流速的关系
对于气相色谱而言
■载气流速低时：
分子扩散项成为影响柱效的主要因素，随着流速的增加，柱
效提高。
■载气流速高时：
传质阻力项是影响柱效的主要因素，随着流速的提高，柱效
下降。
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气相色谱的最佳流速
将H = A + B/u + c·u 微分，得
dH / du   B / u 2  C  0
B / u2  C
u最佳  B / C
H 最小  A  BC  BC  A  2 BC
■在一定的色谱条件下测得三种不同流速下对应的H值，
其中的A、B、C 组成一个三元一次方程组，进而求出A、
B、C值，算出H最小和u最佳
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色谱分离效能的衡量
分离度
分离度是评价一张色谱图以及决定如何解决、开发和优化
分离方法的依据
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分离度与柱效能、选择性的关系
分离度方程
n  2 ,1  1 k '
R


4
 2,1 k '1
n
柱效（塔板数）
γ2,1 相对保留值，反映固定相对两组分的选择性
k’
容量因子（分配比）
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分离度
① 柱效较高， γ2,1较大,完全分离；
② , γ2,1不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；
③ 柱效较低， γ2,1较大,但分离的不好；
④ γ2,1小，柱效低，分离效果更差。
■当R大于1.5时，两峰分离的比例达到99.7%，两种组
分完全分离。
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分离度与柱效能、选择性的关系
原始分离状况
改变k’
改变γ2,1
改变n
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■
色谱定性方法
与标样对照
利用保留值及相对保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质
相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱
图中的位置。但该方法不适用于在不同仪器上获得的数据之间
的对比。
利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰
的相对变化。
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色谱定性方法
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■
色谱定性方法
利用保留指数法定性
保留指数又称Kovats指数（Ⅰ），是一种重现性较好的定性参数。
测定方法：将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原
子个数乘以100（如正己烷的保留指数为600）。其它物质的保
留指数（IX）是通过选定两个相邻的正构烷烃，其分别具有Z和Z
＋1个碳原子。被测物质X的调整保留时间应在相邻两个正构烷
烃的调整保留值之间如图所示：
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色谱定性方法
■与其他分析仪器联用的定性方法(结构鉴定)
色谱的分离功能强大，但定性能力不足，并不能完全确证各个
组分，特别是新化合物，故将色谱与其他分析仪器联用来获得
化合物结构信息，但联用通常涉及较复杂的装置，价格昂贵。
1. 气相色谱-质谱联用仪；
2. 气相色谱-红外光谱联用仪；
3. 液相色谱-质谱联用仪；
4. 液相色谱-核磁共振波谱仪
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色谱定量分析
■校正因子和相对校正因子
试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比，即：
mi=fi ’Ai
比例系数fi’ 称为绝对校正因子，单位面积对应的物质的量：
fi’=mi/Ai
在实际工作中，较多使用相对校正因子 fi ，即组分的绝对校
正因子与标准物质的绝对校正因子之比。
fi 
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fi '
fs '
■
质量校正因子
f 'i ( m ) As mi
fm 

f 's ( m ) Ai ms
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定量方法：归一化法
当试样中所有组分全部出峰,组分数与色谱峰数相符时,可以采
用该法。计算式如下：
mi
mi
Ai f i
wi 


m m1  m2  ...  mn A1 f1  A2 f 2  ...  An f n
如组分性质相近或对准确度要求不高时，可省略式中的校正
因子，此时称面积归一化法。
■特点及要求：
(1)归一化法简便、准确。
(2) 进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大。
(3) 仅适用于试样中所有组分全出峰且组分数与色谱峰数相
符的情况。
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内标法原理
■内标法
将准确称量的纯物质作为内标物，加入到准确称量的试样
中，根据内标物质量ms与样品质量m以及它们的色谱峰面积求
出某一组分含量。如要测定试样中的i组分，其质量为mi,则：
mi  f i Ai
ms  f s As
如内标物就是相对校正因子的标准
物质，则fs=1,fi/fs=fi
mi
f i Ai

ms
f s As
mi Ai ms f i
wi 

m
As m
mi
f i Ai ms
wi 

m
f s As m
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内标法的工作过程
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内标法的工作过程
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内标法
■对内标物的要求
–化学结构与待测组分相似(同系物、异构体)
–在样品中不存在
–不与样品中组份发生任何化学反应
–保留值与待测组分接近
–浓度（响应值）与待测组分相当
–其色谱峰与其它色谱峰分离好
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定量方法：外标法
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定量方法：外标法
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定量方法：外标法与内标法
■外标法
–在液相色谱中用得最多
■内标法
–准确，但是麻烦
–在标准方法中用得最多
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Thank You!
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