Transcript 세포의 대사활성에 기초

박종철
연세대학교 의과대학 의학공학교실
• Cell의 Viability란 무엇인가?
- 성장
- 증식
- 대사활성 등
• Cell Viability의 측정
- 측정방법에 따라서 차이가 발생
: 각 측정법에서 별도의 정의를 사용
[예] Trypan blue 염색: 세포막의 integrity에 기초한 염색
형광염색: 세포내 효소의 활성에 기초한 염색
Isotope: 세포의 대사활성에 기초
- 종래의 방법
: (Macro) 성장, 증식
- 최근 시도되고 있는 방법
: (Micro) 성장, 증식, 대사활성, 세포막 손상 등
• Cell viability 측정의 응용
- 조직공학
- 발효공학
- 독성학
- 위생학 (식품,환경 등)
- 생명공학
• Cell viability 측정 방법의 선택시 고려사항
- 신속성
- 정확성 (정량적)
- 경제성
- 용이성
• 발효과정의 세포수 측정 시스템에 요구되는 특징
(by Dr. Matsunaga)
- 응답이 빠르고, 연속적으로 측정이 가능
- 높은 감도
- 측정부분이 생물학적으로 불활성
- 시약을 첨가할 필요가 없음
- 비파괴적 측정법
- 광범위한 적용범위
- 수명이 길고, 저렴
- 혼탁한 시료라도 사용가능
- 멸균가능
• Viability 측정 방법
 검경법 (염색법)
 생균수 측정법: 군집 (colony) 형성
 흡광도, 탁도 측정법
 일반적 효소활성 확인법: API ZYM
 Isotope 사용법
 형광염색법: FDA-PI
 발광 확인법: Luciferin-Luciferase
 극미약광 측정법
 영상처리법
 생물진동 확인법
 막전위 측정법
 검경법 (염색법)
- 세포수 측정법의 기본, 가장 일반적
- Haematocytometer를 사용하여, 세포농도를 구함
- 적당한 염색제를 사용하여 viability 측정이 가능
- 단점: 조작이 복잡하고 기술과 경험이 필요
106 cells/ml 이하의 세포농도에서 측정불가능
pH 변화: Neutral Red, Phenolphthalein
핵산의 염색: Acridine Orange, Ethidium Bromide
세포막 변형: Tryphan Blue
세포 mitochodria내의 효소 활성: MTT
Trypan Blue: an indicator of cell integrity
Viable cell
Dead cell
• Viable cells
exclude acidic dye
Blue stained
Neutral Red: an indicator of lysosome integrity
Viable cell
Dead cell
• Neutral Red is endocytosed by
vital cells and internalized
inside lysosome
Red Stained
MTT assay
: Cell viability by mitochondrial dehydrogenase
Substrate (MTT)
Insoluble colored
formazen (product)
• MTT is converted to an
insoluble colored formazan
Substrate (MTT)
Mitochondria
Mitochondrial
dehydrogenase
Substrate (MTT)
derivative which is then
solubilized in acidic
isopropanol
 군집형성측정법 (Colony 계수법)
- 생균수 측정법의 기본
- 피검액 일정량을 한천(agar) 배지와 섞어 배양하여,
생성된 colony를 계수. (Bateria)
- 한천배지위에 일정량의 세포현탁액을 도말하여 배양한 후,
생성된 colony를 계수. (Fungi, Animal cell, Plant cell)
- 선택 배지를 사용하면, 세포의 식별도 가능
- 세포수 측정한계: 1 cell/ml
- 임상의학에서는 가장 일반적
- 단점: 죽은 세포의 계수가 불가능
측정에 장시간 (24시간 이상) 필요로함
시스템화가 곤란
Colony 계수법
Sample
Determination of the number of colony
Spreading of sample
Culture
Plate with fresh agar
 흡광도, 탁도 측정법
- 총물질로 탁도를 측정하는 방법
세포내 함유된 특정물질을 추출하여 측정
- 세포농도의 탁도 측정에는 투과광과 산란광 고려
- 세포현탁액에 의한 산란광의 세기에 영향을 미치는 요인
: 세포농도, 크기, 형태, 세포성분 등
- 피검액이 일정하다면, 산란광의 세기는 총세포수에 대응
- 간편, 일정수주의 정밀도를 가짐
- 측정한계: 106 cells/ml
- 단점: Cell viability 측정 불가
세포간 식별 불가
고형분을 함유한 검체의 정확한 측정 곤란
진한색의 배지 사용할 때 정확한 측정 곤란
 일반적 효소 활성 확인법
-API ZYM
- 19 종류의 일반적인 지질, 단백질, 당 분해 효소의 활성
1. Phosphatase alkaline
10. Phosphatase acid
2. Esterase (C4)
11. Naphthol-AS-B1-phosphohydrolase
3. Esterase Lipase (C8)
12. -galactosidase
4. Lipase (C14)
13. -galactosidase
5. Leucine arylamidase
14. -glucuronidase
6. Valine arylamidase
15. -glucosidase
7. Cystein arylamidase
16. -glucosidase
8. Trypsin
17. N-acetyl--glucosaminidase
9. Chymotrypsin
18. -mannosidase
19. -fucosidase
 Isotope 사용법
• Principle: Cell must continually synthesize protein
in order to remain viable
3H-Proline
Accumulation
Synthesis
Incorporation
of protein
Viable cell
Measurement of
protein concentration and
radio-labelled amino acids
- 3H-Proline: generally used because it is not compete with
other amino acids during transport within cell
- 3H-thymidine: related with the number of cells replicating
DNA as well as that of accumulated radiolabelled
amino acids
 형광 염색법: Assessment of Viability by Double-Staining
PI
FDA
515 nm
F
Esterase
Viable Cell
PI: Propidium Iodide
FDA: Fluoresein Diacetate
F
F F
F
(Fluorescence)
488 nm
(Excitation)
PI
Non-viable
Cell
FDA
PI
PI PI
620 nm
(Fluorescence)
Flow-Cytometry (FCM)
Cell Suspension
[- control]
: non-staining
前方散亂光
[ Scatter ]
Living cells
Laser-Beam
螢光
[ Fluorescence ]
Dead cells
 ATP 측정법 (Bioluminescence)
- 세포내 특정물질의 광학적 측정법
- 세포중의 ATP는 성장과정, 배양조건에 관계없이 거의 일정
- 세포로부터 추출된 ATP와 반딧불의 Luciferin-Luciferase 반응
 생성된 형광 강도를 측정
- 세포를 직접 탁도로 측정하는 것보다 감도가 높음
- 단점: 추출 조작등 복잡 (ATP 소실 가능성)
파괴적 측정
결과를 얻기까지 시간을 요함 (현재는 해결됨)
배지중의 ATP, 금속이온 등이 영향
죽은 세포의 측정이 불가능
- Firefly bioluminescence
Luciferin + Luciferase + Mg2+ + ATP  Luciferyladenylate L-AMP
L-AMP-luciferase + O2  Oxyluciferin*-luciferase
Oxyluciferin*-luciferase  Oxyluciferin-Luciferase + Light (562 nm)
- Bacterial luminescence
Photobacterium phosphoreum, Vibrio harveyi
NAD(P)H + FMN
Oxido reductase
FMNH2 + NAD(P)
FMNH2 + Luciferase +O2  FMNH(OOH)•luciferase
FMNH(OOH)•luciferase + RCHO  FMN + R•COOH + Luciferase
H2O + Light
Principle of Bioluminescence Assay Method
Cell Lysis
+ Luciferin + O2
In the presence of
Luciferase & Mg2+
AMP + CO + Pyrophosphoric Acid + Oxyluciferin + Luminescence
(480 nm)
 극미약광 측정법
- 광전자계수법에 기초하여, 고감도 발광검출장치로 측정
Noise를 줄이기 위하여 (진공) 냉각 방식을 채용
Liquid nitrogen CCD camera 사용
감도: 수개의 광자 (photon) / 10 sec
• 극미약광 발광 Mechanism
1. Chemiexitation
2. Superhelical DNA
1. Chemiexitation
Mitochondria의 전자전달계에서 전자유출과 동시에
활성물질 (O2-, OH, O2*, H2O2, Fe2+/Fe3+)이 생성되어
Unsaturated fatty acid와 반응하여 singlet oxygen(O2*) 생성
O2*가 unsaturated compound (lipid, phospholipid, ubiquinone)
과 반응하여 chemiluminescent reaction
2. Superhelical DNA
DNA
gyrase
DNA
gyrase
ATP
no ATP
G < 0
Positively
supertwisted DNA
relaxed
Negatively
supertwisted DNA
Supertwisted DNA가 복제를 위하여 relaxation될 때,
supertwist 9개당 -225kj/mol의 G가 발생하여,
이 energy로 극미양발광이 가능한 exited nucleotide 생성
• 극미약발광의 예
동물세포: 간장, 근육, 심장, 신경, 혈구세포 등
발광정도는 3-20분간 세포 1개당 1 photon 정도
파장은 400-700 nm
식물세포: 여러 식물이 발아할 때, Meiosis하는 세포로부터
극미약광의 변화 확인
(superhelical DNA가 원인으로 추측)
Yeast (Saccharomyces cerevisiae)
Logarithmic phase의 경우 UV파장이 많음
Stationary phase의 경우 가시파장이 많음
Budding할 때 발광이 강함
 막전위 (membrane potential) 측정법
- Transmembrane proton gradient
pmf (proton motive force)를 가짐
pmf의 electrical component의 단위: mV
- Bacteria에서 outward proton pumping 결과
Plasmic (inner) side: alkaline, electrically (-)
relative to the periplasmic (outer) side
- Mitochodria
Matrix side of the inner memb: relatively alkaline, (-)
-Chloroplast (thylakoid memb)
광합성중에 inward proton pumping
outer side: alkaline, electrically (-)
- 막전위 측정 방법
micro-electrode injection: injection 위치 파악 곤란
dis-C3-5: 형광
merocyanin 540: 형광