Transcript MALDI-TOF Mass의 원리 및 응용 M A

MALDI-TOF Mass의 원리 및 응용
(Matrix Assisted
Laser Desorption Ionization – Time Of Flight Mass Spectrometry)
MALDI 시료 플레이트에 준비
Sample
plate
Laser
hn
1.
시료 (A) 가 과량의 매트릭스 (M) 과 혼합
되어 MALDI plate에 건조됨.
2.
레이저 섬광이 매트릭스 분자들을 이온화
함.
3.
시료분자들이 매트릭스로부터 proton
transfer 에 의해 이온화됨:
AH+
MH+ + A  M + AH+.
+20 kV
Variable Ground
Grid
Grid
• 매트릭스 는 유기산 (organic acid : M) 종류를 사용
• 여기에서는 시료가 protonation 되는 것을 설명하고 있으나, 물질에 따라 deprotonation 이 쉽게 되어 이온화 되는
경우도 있음.
• 측정되는 질량값은 시료분자 (A)의 분자량+1 이거나, 분자량-1 임
TOF에서 분자 이온들의 분리
Flight Tube (0.5 –
4m)
Ion Source (4 – 25 KV)
가벼운 이온들은 무거운 이온들보다 먼저 검출기에 도착한다.
Detector
Reflector TOF내 분자이온의 비행
Detector
4-25 kV
Flight
Tube
Ion
Source
Reflector (Ion Mirror)
Reflector 또는 ion mirror 는 이온발생 부위에서 동일한 질량의 이온들이 초기 에너지 분포(initial energy spread)를 갖는 것
을 보정하여 분리능을 증가 시킨다.
 주어진 진공상태의 비행관 (tube) 내에서 이온이 비행할 수 있는 거리를 길게 해주어
분리능(resolution)을 향상 되는 디자인
 Peptide등의 정확한 질량 분석이 필요한 Proteomics 응용에 적합함
 Reflector (ion mirror)를 비행관의 끝에 설치하여 이온 비행 방향을 바꾸어 주고 또 하나
의 검출기(detector) 를 반대편에 설치함.
 이 디자인의 장비로는 응용에 따라 Linear 또는 Reflector 모드로 사용함
DLS & SLS 의 원리
Center for Supramolecular Nano-Assembly
DLS (Dynamic Light Scattering)
< 산란광의 세기 변화 >
분자의 운동은 분자간의 상대적인
Light intensity at 0
위치 변화 를 일으키게 하고 이에
따른 위상변화의 결과로 빛의 간
섭현상이 시간에 따라 변화 하게
되므로 산란광의 세기가 시간에
time
Photon detections
따라 변화
< 상관 관계 함수 >
I·I
즉, 산란광 세기의 시간에 따른 변
G()
화를 추적 - 분자의 운동 - 분자들의
 I 2
확산 계수 - 분자의 크기를 알 수 있
음
time
G() = I(t)I(t + )
DLS (Dynamic Light Scattering)
DLS의 구성
동적 광산란 실험에서는 일정한 시간 간격 (t ) 사이에
PMT( photo-multiplier tube )에 도달하는 광량자의 수를 세어서
그들 사이의 time auto-correlation function을 계산하게 된다.
G() = n (t, t ) n (t+, t ) 
DLS (Dynamic Light Scattering)
확산계수 측정
* g(t) = 1 + Aexp(-2 Γt), Γ = 1/τ) ; 이완시간의 역수를 지수감소
율 (exponential decay rate, Γ) 로 정의
Semilog plot
* 각도에 따른 Γ vs. q2 plot
확산계수와 지수감소율 사이의 관계
* Γ = Dq2
Stokes-Einstein 식 이용 (D = kT/f, f = 6πηRh)
* Rh를 결정
140
o
40 deg
50 deg
70 deg
90 deg
110 deg
0.4
120
0.2
0.1
<Rh> = 44.2 nm
100
Intensity (a.u.)
g(t)
0.3
40
o
50
o
70
o
90
80
60
40
20
0.0
0
10
100
1000
t / s
10000
1
10
100
Diameter (nm)
1000
DLS (Dynamic Light Scattering)
0.40
0.30
0.25
0.20
0.15
1.6
2
Dt = 2718 nm /ms
Rh = 102 nm
1.4
1.2
1.0

2
g (t)-1
1.8
30 deg
45 deg
60 deg
75 deg
90 deg
105 deg
130 deg
145 deg
0.35
0.8
0.10
0.6
0.05
0.4
0.00
0.2
-0.05
1E-5
1E-4
1E-3
0.01
0.1
1
10
Lag time (ms)
100
1000 10000 100000
0.0
0.0000
0.0001
0.0002
0.0003
0.0004
q
2
0.0005
0.0006
0.0007
SEM
H2O
THF
TEM
100 nm
J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 6294.
RO
OR
RO
OR
DLS
A
OR
N
N
TEM
OR
OR
RO
100nm
N
N
A
100 nm
O
O
B
O
O
18nm
B
50 nm
C
3nm
A: R=
H
B: R=
OH
C: R=
O
10 nm
C
1
OH
J. Am. Chem. Soc. 2004, in press
10
100
Radius (nm)
1000
10000
Zimm Plot vs. Berry Plot
Zimm plot:
분자량, 제 2 비리얼 계수 그리고 관성 회전반경을 구하는 방법
으로 주로 사용 (Kc / R(θ) vs. sin2(θ) + kc)
Berry plot (square root plot):
큰 분자량의 zimm plot에서는 위로 약간 휘어지는 모양이 나타
나 실제 보다 약간 큰 분자량과 관성 회전반경이 구해짐. 이 경
우 berry plot을 이용 ((Kc / R(θ))1/2 vs. sin2(θ) + kc)
Zimm Plot of a PS Standard
-3
3.5x10
0.845
-3
3.0x10
-3
Kc/R
2.5x10
1.203 mg/mL
1.013
0.50
c=0
=0
-3
2.0x10
-3
Mw = 704k
Rg = 35.8 nm
1.5x10
-3
-4
1.0x10
3
A = 4.26 x 10 cm ·mol/g
2
-4
5.0x10
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
2
sin () + 100c
2
2 2
2

 / 2  1
16

n
R
sin
 

g
Kc
1  1



=
 2 A2 c    1 

2
A
c
2 
2


R  P   M w
3o
 M w
 


Static Light Scattering in water/THF
2.0x10
-7
7
Kc/R (mol/g)
1.5x10
1.0x10
Mw = 2.18 x 10 (g/mol)
Rg = 48.8 (nm)
A2 = -2.9812E-6
Aggregation no. = 10,380
2
Area per molecule = 2.88 nm
-7
Aggregation number
2.18 x 107 g/mol (micelle) / 2,100 (rod-coil)
= 10,400
Area per molecule
4(48.8 nm)2 / 10,400 = 2.88 nm2 / molecule
-6
5 x 10 (g/mL)
-7
-6
6 x 10
-6
7 x 10
-6
8 x 10
5.0x10
Rg/ Rh = 48.8/44.2 = 1.10
-8
1 x 10
-5
Rg/Rh
0.0
-5.0x10
Uniform sphere: 0.774
Polymer coil: 1.50
Spherical Shell: 1.0
-8
0
4
8
2
12
6
SIN (/2) + 10 c
16
Calculation of Rg
ln(I(q))
Rg2 / 3
q2/cm-2
ln( I (q)) = ln( I (0)) 
q 2 Rg2
3