MEZENKİMAL KÖK HÜCRE ÜRETİMİNDE SORUNLAR VE ÇÖZÜMLERİ

Dr. Fahri ŞAHİN Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hematoloji Bilim Dalı

MKH ÜRETİMİ ve SORUNLAR

Sorunlar

• Örnek alımı • MNH eldesi • Kültüre etme • Tripsinizasyon • Pasaj • Tanımlama / Diferansiyasyon • Etik / Yasal sorunlar

Örnek Alımı

Kortikal Kemik Spongioz Kemik Kemik İliği

KİA 800g 20 Dak Fikol Santrifüj Plazma MNH tabakası Fikol Eritrosit Taze BY Yıkama 48-72 saat inkübasyon Nonadheren hücrelerin atılması İnkübasyon

Tripsinizasyon Tripsin - EDTA 5 dk İnkübasyon

Tripsin blokajı ve yıkama Serum içeren Media veya PBS 800G 10 dk Tekrar kültür ve tripsinizasyon ile 2-6 pasaj

FBS

Son yıllara kadar MKH lerin

in vitro

ekspansiyonu için

SERUM (FBS) 10 % FETAL BOVİNE

kullanılıyordu • Virüs, bakteri, prion bulaşı • İmmün veya lokal inflamatuar reaksiyonlar • Engrafman yetmezliği, rejeksiyon Otolog serum kullanımını gündeme getirmiştir

%1 OS %10 OS A %10 FBS C %3 OS B

Proliferasyon : C > D = B > A Osteojenik Dif. : C +++ > D ++ > B + > A 0 Adipojenik Dif. : D +++ > C ++ > B + > A 0 Norbert Stutea et al. Autologous serum for isolation and expansion of human mesenchymal stem cells for clinical use. Experimental Hematology 2004 (

Hamburg, Germany

)

D

Türler arasında farklılık

• İnsan, sıçan ve tavşanda MKH üretim nispeten kolay • Farede üretim oldukça sıkıntılıdır

• Farelerin 5-florourasil ile muamelesi • CD11b’ ye karşı antikor ile immündeplesyon • BY değişikliği: – DMEM yerine α-MEM – Düşük glukoz içerikli BY

Üretilen MKH’ lerin Kalite Kontrolü 1. Flowsitometrik değerlendirme • • CD11b, CD31, CD34 ve CD45 negatif SH2 (CD105), SH3 veya SH4 (CD73), CD117 (c-kit), CD90 (Thy-1) ve STRO-1 pozitif

Üretilen MKH’ lerin Kalite Kontrolü 2. Diferansiyasyon özelliğinin değerlendirilmesi * Osteojenik diferansiyasyon * Kondrojenik diferansiyasyon * Adipojenik diferansiyasyon

Osteojenik Diferansiyasyon Alkalen fosfataz aktivitesi

Kalsiyum fosfat (Apatit) birikimi ( X-Ray) ESM mineralizasyonu von Kossa boyası

Kondrojenik Diferansiyasyon Gümüş mavisi boyası Safranin O boyası

Adipojenik Diferansiyasyon Lipidden zengin vakuollerin intraselüler birikimi Oil-Red O boyası

Good Manufacturing Practice GMP

For Tissue Engineering…… That is not dead which can eternal lie, And with strange aeons even death may die Howard Lovecraft This is not the end This is not even the beginning of the end But it is the end of the beginning Winston Churchill