Transcript Mezankimal Kök Hücre üretiminde karşılaşılan sorunlar
MEZENKİMAL KÖK HÜCRE ÜRETİMİNDE SORUNLAR VE ÇÖZÜMLERİ
Dr. Fahri ŞAHİN Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Hematoloji Bilim Dalı
MKH ÜRETİMİ ve SORUNLAR
Sorunlar
• Örnek alımı • MNH eldesi • Kültüre etme • Tripsinizasyon • Pasaj • Tanımlama / Diferansiyasyon • Etik / Yasal sorunlar
Örnek Alımı
Kortikal Kemik Spongioz Kemik Kemik İliği
KİA 800g 20 Dak Fikol Santrifüj Plazma MNH tabakası Fikol Eritrosit Taze BY Yıkama 48-72 saat inkübasyon Nonadheren hücrelerin atılması İnkübasyon
Tripsinizasyon Tripsin - EDTA 5 dk İnkübasyon
Tripsin blokajı ve yıkama Serum içeren Media veya PBS 800G 10 dk Tekrar kültür ve tripsinizasyon ile 2-6 pasaj
FBS
Son yıllara kadar MKH lerin
in vitro
ekspansiyonu için
SERUM (FBS) 10 % FETAL BOVİNE
kullanılıyordu • Virüs, bakteri, prion bulaşı • İmmün veya lokal inflamatuar reaksiyonlar • Engrafman yetmezliği, rejeksiyon Otolog serum kullanımını gündeme getirmiştir
%1 OS %10 OS A %10 FBS C %3 OS B
Proliferasyon : C > D = B > A Osteojenik Dif. : C +++ > D ++ > B + > A 0 Adipojenik Dif. : D +++ > C ++ > B + > A 0 Norbert Stutea et al. Autologous serum for isolation and expansion of human mesenchymal stem cells for clinical use. Experimental Hematology 2004 (
Hamburg, Germany
)
D
Türler arasında farklılık
• İnsan, sıçan ve tavşanda MKH üretim nispeten kolay • Farede üretim oldukça sıkıntılıdır
• Farelerin 5-florourasil ile muamelesi • CD11b’ ye karşı antikor ile immündeplesyon • BY değişikliği: – DMEM yerine α-MEM – Düşük glukoz içerikli BY
Üretilen MKH’ lerin Kalite Kontrolü 1. Flowsitometrik değerlendirme • • CD11b, CD31, CD34 ve CD45 negatif SH2 (CD105), SH3 veya SH4 (CD73), CD117 (c-kit), CD90 (Thy-1) ve STRO-1 pozitif
Üretilen MKH’ lerin Kalite Kontrolü 2. Diferansiyasyon özelliğinin değerlendirilmesi * Osteojenik diferansiyasyon * Kondrojenik diferansiyasyon * Adipojenik diferansiyasyon
Osteojenik Diferansiyasyon Alkalen fosfataz aktivitesi
Kalsiyum fosfat (Apatit) birikimi ( X-Ray) ESM mineralizasyonu von Kossa boyası
Kondrojenik Diferansiyasyon Gümüş mavisi boyası Safranin O boyası
Adipojenik Diferansiyasyon Lipidden zengin vakuollerin intraselüler birikimi Oil-Red O boyası
Good Manufacturing Practice GMP
For Tissue Engineering…… That is not dead which can eternal lie, And with strange aeons even death may die Howard Lovecraft This is not the end This is not even the beginning of the end But it is the end of the beginning Winston Churchill