Transcript 薄层色谱分离菠菜叶中的色素

薄层色谱分离菠菜叶中的色素
一、实验目的
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1.学习色谱法的原理和方法。
2.学习薄层色谱法进行定性分析的原理。
3.学习并掌握薄层色谱法的操作技术。
4. 练习植物中色素提取的基本思路和方法。
二、实验原理
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色谱法最初是由俄国植物学家茨维特在1906研究用碳酸钙
在玻璃柱中分离植物色素时发现，色谱法
（Chromatography)因之得名。色谱法发展到今天，已有
柱色谱、薄层色谱、纸色谱、液相色谱、气相色谱等多种
形式。
色谱法又称层析法、色层法，是分离、提纯和鉴别有机化
合物的重要方法之一。色谱法的基本原理是利用混合物各
组分在某一物质中的吸附或溶解性能 (即分配)的不同，使
混合物的各组分流经该种物质，进行反复的吸附或分配等
作用，从而将各组分分开。
这一方法在化学化工、生物学、医学中得到了普遍应用。
三、实验用品
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1.仪器：展开缸 、分液漏斗、 研钵、玻璃板
(3cm×1Ocm)、锥形瓶(50mL)、量筒
(10mL)、点样用毛细管，烧杯（100mL）
2.试剂：硅胶G、石油醚 (60-90℃)、饱和
NaCl溶液、C2H5OH、C6H6、CH3COCH3、
无水Na2SO4
四、实验步骤
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1.薄层板的制备
(1)制备薄层载片
将玻璃板要用洗衣粉和水洗涤，再用水
淋洗，然后用50%甲醇溶液淋洗，让片完全
干燥，取用时应让手指接触玻璃片的边缘，
因为指印沾污片的表面上将使吸附剂难于铺
在片上。
(2)制备浆料
不同吸附剂所用溶剂量有所不同：
一般1g硅胶G需要0.5%CMC清液34mL或约3mL氯仿或水；1g氧化铝需
要0.5%CMC清液约2mL；
本实验用蒸馏水为溶剂
要求：制成的浆料要求要均匀，不带团块，
粘稠适当。
方法：
应将吸附剂慢慢地加至溶剂中，边加边
搅拌，最好用广口瓶，旋紧盖子，将瓶剧烈
摇动，保证充分混和；
或用磁力搅拌器搅拌；
或用匀浆机匀浆；
或用研钵研匀
(3)铺板
要求：薄层板制备的好坏是薄层色谱法成败的关键，
为此，薄层必须尽量均匀且厚度 (0.25-1mm)要固定。
方法：
倾注法
平铺法
浸涂法
固化: 将铺好的薄层板放在己
校正平面的平板上晾干。
活化： 将干透的薄层板置于烘箱中
加热活化。活化时需慢慢升温，硅
胶在约110℃左右活化30-60分钟可
得Ⅳ-Ⅴ级活性的薄层板。
四、实验步骤
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2.配制展开剂
将 苯:丙酮:石油醚按2 : 1 : 2V/V混合共
20mL倒入干净且干燥的层析缸中，盖好盖子，
备用。一般展开剂要配好后饱和15-30min后
才可使用。
四、实验步骤
3. 叶绿素的提取
在研钵中放人几片 （约
5g）菠菜叶 (新鲜的或冷冻
的都可以，如果是冷冻的。
解冻后包在纸中轻压吸去水
分)，加入1OmL2:1的石油
醚和乙醇混合液，适当研磨
(不要研成糊状，否则会给
分离造成困难)。
将提取液用滴管转移至小分液
漏斗中，加入10mL饱和NaCl溶液
(防止生成乳浊液)除去水溶性物质，
分去水层；
再用蒸馏水洗涤两次；
将有机层转入干燥的小锥形瓶
中，加2g无水Na2SO4干燥；
干燥后的液体倾至另一锥形瓶
中。
4.点样
在距薄层一端8-10mm处，划一条线，做为起点线。
用毛细管 (内径小于1mm)吸取样品溶液垂直地轻轻接触
到薄层的起点线上。如溶液太稀，一次点样不够，第一次点样
干后，再点第二次，第三次。多次点样时，每次点样都应点在
同一圆心上，点的次数依样品溶液浓度而定，一般为2-5次，
若样品量太少时，有的成分不易显出；若量太多时易造成斑点
过大，互相交叉或拖尾，不能得到很好的分离。
点样后的斑点直径一般为1-2mm为圆点。若为多处点样
时，则点样间距为1-1.5cm。
5.展开
薄层的展开需
在密闭的容器中进
行。 将点好样的
薄层板放人色谱器
中进行展开。 点
样的位置必须在展
开剂液面之上
当展开剂上升到薄层的前沿 (离顶
端5-10mm)或各组分已明显分开时，
取出薄层板用铅笔或小针划出前沿的
位置即终点线，放平晾干，之后即显
色，如果为无色物质，需喷显色剂显
色。
6.计算比移值
显色后，记下各斑点中
心位置，通常用比移值Rf表
示物质移动的相对距离。
Rf=
×ÔÔ-µã ʼÈÜÖÊËù×ߵľàÀë
×ÔÔ-µã ʼÈܼÁËù×ߵľàÀë
影响Rf值的因素：
分析方法（薄层色谱、纸色
谱）；固定相的种类，流动相的种
类（展开剂）；温度；物质的分子
结构等。
起
点
线
根据Rf值的不同对各组分进行
鉴定，因此色谱法可以用于物质的
鉴定、分离、纯化。
7.结果（计算各色素的比移值）
终点线
脱
镁
叶
绿
素
胡萝卜素
叶绿素a
叶绿素b
叶黄素
起点线