Transcript Yüzey plazmon rezonans(SPR)

Yüzey plazmon rezonans sistemi ve
mikroorganizma tayinine yönelik
biyosensör hazırlanması
Prof. Dr. İsmail Hakkı BOYACI
Hacettepe Üniversitesi,
Gıda Mühendisliği Bölümü, Beytepe Ankara
[email protected]
Neden mikroorganizma tayini?
 Halk sağlığı
 Çevre sağlığı
 Gıda güvenliği
 Biyogüvenlik
 Biyoterör ajanı
Staphylococcus aureus
2
Mikroorganizma tayini yöntemleri
 Kültürel yöntemler
 Mikroskobik yöntemler
 Kimyasal yöntemler
 Fiziksel yöntemler
 Biyokimyasal yöntemler
 Moleküler yöntemler
 İmmünolojik yöntemler
 Biyosensörler
3
Mikroorganizma tayini yöntemleri
 A. Diret sayım yöntemleri
 Kültür sayım yöntemleri (dökme plak, çift tabakalı
dökme plak,agar damlatma yöntemi, membran filtre
sayım yöntemleri ve diğer yöntemler)
 Mikroskopik sayım yöntemleri (Thoma lamı, Howard
lamı, membran fitre ve diğer sayım yöntemleri)
 Flow sitometresi
 B. İndiret sayım yöntemleri
4






En muhtemel sayı yöntemi,
Tüp dilisyon yöntemi
Türbidimetrik sayım yöntemi
Hücre içi reaktifine dayalı yöntemler
Metabolik aktiviteye dayalı sayım yöntemleri
Kuru maddeye tayinine dayalı sayım yöntemi
Kültürel yöntemler
 Uzun inkübasyon sürelerine gereksinim
duyulmaktadır.
 Zahmetli yöntemlerdir.
5
Analiz süresi 1-7 gün arasında değişmektedir.
Mikrobiyolojik analizlerde hızlı
yöntemlere gereksinim duyulmaktadır.
HEDEF
100 ml içme suyu içerisindeki 1
Escherichia coli’nin saptanması.
Hızlı
Hassas
Seçici
6
BİYOSENSÖR
 Biyolojik tanıma mekanizmasına sahip, hedef molekül
derşimine orantılı sinyaller üreten analiz sistemlerine
biyosensör denir.
Referans
(a) Biyoajan (b) Çevirici (c) Yükseltici (d) İşlemci (e) Gösterge
7
Bioajanlar
 Antikor
 Elektrokimyasal
 DNA
 Elektriksel
 Enzim
 Optik
 Protein
 Kütle hassas
 Mikroorganizma
 Termal
 Bitkisel ve hayvansal dokular
 Aptamer
8
Çeviriciler
Yüzey plazmon rezonans sistemi (SPR):
 Polarize ışık, yüzeyi altın kaplı bir prizmaya gönderildiğinde ışığın bir kısmı
absorplanmakta, bir kısmı da yansımakatdır. Geliş açısı değiştirilip yansıyan
ışığın şiddeti izlendiğinde yansıyan ışık şiddetinde azalma görülür. Yansıyan
ışığın şiddetinde maksimum kaybın gerçekleştiği açıya rezonans açısı ya da
SPR açısı adı verilir.
 Bu geliş açısında ışık, yüzey plazmonlarını (elektron paketçikleri) harekete
geçirecek, yüzey plazmon rezonans olayı gerçekleşecektir. Yüzey plazmon
rezonansı iki optik ortamın ara yüzeyine ince iletken bir film
yerleştirildiğinde meydana gelir. Spesifik bir geliş açısında metal yüzeyindeki
elektron frekanslarının eşleşmeleri nedeniyle gelen ışık ile rezonans
durumuna gelecektir. Bu rezonans durumunda enerji absorblanacağı için
yansıyan ışının yoğunluğunda bir azalma meydana gelmektedir.
Dielektrik
SPW ( penetrrasyon derinliği ~400 nm)
Altın tabaka(~50 nm)
(tampon + örnek)
Cam
9
Uyarma
Yansıma
 Metal yüzeyiyle temas halinde ortamın özelliklerinin
değişmesi veya yüzeyde birikim sağlanması durumunda
rezonans açısı değişmektedir.
 Yüzeyde birikim kontrollü olarak sağlanması
durumunda birikin madder derişimiyle ilgili kantitatif
sensör çalışmalaırnda kullanılabilmektedir.
 Bu amaçla zamana karşı SPR açısını takip eden ticari
sistemler geliştirilmiştir.
SPR Sinyalinde Kayma
Reflaktif Indeks (RI)
Kayması-Zaman Grafiği
Molecule
10
Rinse
11
Krestschmann ATR
Otto
Pirizma
Altın yüzey
Akış hüçresi
12
Deney düzeneği
 SpreetaTM sesnör
(Texas Instruments, Dallas, TX)
13
Antikorun tutuklanması
 Yüzeyin temizlenmsi
 Avidin ile kaplanması (1 mg/ml, 10 μl/min)
 Yıkama
Streptavidin
Au yüzey
14
Antikorun tutuklanması-2
 Biyotin işaretli anti-E. coli antikorunun yüzeye başlanması
 Yıkama, tampon
 Yıkama, % 1SDS
Biotin conjugated
antibodies
15
Antikor tutuklama
12500
Antikor
PBS
11500
Response Unit (RU)
PBS
10500
9500
Glisin
SDS
Streptavidin
8500
7500
SDS
SDS
6500
PBS
5500
4500
3500
0
2500
5000
7500
10000
12500
15000
17500
Time
(sec)
Süre
(Saniye)
Yüzeye streptavidinin ve biyotin işaretli antikorun bağlanması sonucunda sensör
cevabı
16
Bakteri tayini
E. coli
 Örnek enjeksiyonu (1 ml)
 Yıkama
 Rejenerasyon, % 1 SDS
 Farklı derişimlerde E. coli (~ 102 to 106 kob/ml) örneklerden 1 mL
sensör yüzeyle etkilşemesi sağlanmaktadırwere injected.
 Uygun yıkama çözeltileri ile yıkama gerçekleşmektedir.
 Örneklem sonrasında sensör cevabında meydana gelen değişimler
kaydedilmekte ve sonrasında kalibrasyon grafiği üretilmketedir.
 Sensör yüzeyi uygun çözeltilerle temizlenerek tekrar
kullanılmaktadır.
17
Immunosensors using surface plasmon
resonance (Real time antigen determination)
The response (RU) to binding of E. coli and regeneration. Injection of
 A) E. coli solution (9.0×101 cfu ml-1); B) PBS; C) %1 SDS solution;
 D) E. coli solution(1.8×103 cfu ml-1);
E) E. coli solution(1.8×105 cfu ml-1).

18
Reusability
600
Response Units (RU)
500
400
300
200
100
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
Runs
The sensor responses for E. coli solution (~103 cfu/ml) intra-day.
19
Selectivity
800
Change in Response Unit ( D RU)
700
600
500
400
300
200
100
0
E.aerogenes
E.coli
E.dissolvens
The change in RU induced by the binding E. aerogenes (1.8×105 cfu/ml)
and E. dissolvens (1.4×104 cfu/ml) and E. coli (1.8×104 cfu/ml).
20
Real water samples
Table.The results of real water samples obtained from the developed immunosensor and plate
counting method
SPR-based immunosensor
(cfu ml-1)
Plate counting method
(cfu ml-1)
River
< Detection Limit
Not Detected
Lake
2.4 × 102
5.6 × 102
E. coli inoculated tap water
1.9 × 104
3.1 × 104
Water Source
21
Sonuç…






22
SPR sistemi kullanılarak çok farklı hedef moleküle
karşı biyonsensör geliştirilebilmekte farklı
etkileşimler takip edilebilmektedir.
Diğer biyosensörlere göre daha hızlı, hassas ve
seçici uygulamalar gerçekleştirilebilmektedir.
En önemli avantajı sandviç analizlerde olduğu gibi
ikincil tanıyıcı molekül gereksinim duymamasıdır.
Aynı SPR yüzeyleri tekrar tekrar
kullanılabilmektedir.
Sistem optimize edilerek taşınabilir sistemlerin
geliştirilmesi mümkün olabilmektedir.
Yaygın kullanıma uygun bir teknolojidir.
Daha fazla bilgi için:
 F. Baldini, A. N. Chester, J. Homola, and S. Martellucci (editors): Optical




Chemical Sensors, NATO Science Series II, Vol. 224, Springer, 2006.
J. Homola (editor): Surface Plasmon Resonance Based Sensors, Springer,
2006.
M. Piliarik, H. Vaisocherová, J. Homola: Surface Plasmon Resonance
Biosensing, in Biosensors and Biodetection, Methods in Molecular
Biology, Vol. 503, editors A. Rasooly, K. E. Herold, Humana Press, 2009,
65-88.
Dudak F.C., İ.H. Boyacı, Development of an Immunosensor Based On
Surface Plasmon Resonance for Enumeration of Escherichia coli in Water
Samples, Food Research International, 40, 803-807 (2007).
Dudak F.C., İ.H. Boyacı, Rapid and label-free bacteria detection by surface
plasmon resonance (SPR) biosensors, Biotechnology Journal 7 1003-1011
(2009).
 [email protected]
23