Transcript Optical tweezers

Lézercsipesz
Optika szeminárium
Butykai Ádám, Orbán Ágnes
2012. április 5.
Tartalom
 A működés alapjai
 Sugároptika
 Maxwell-egyenetek
 Gyakorlati megvalósítás
 Alkalmazási területek
 Legmodernebb berendezések alapelvei
 Lézeres rácsok
 Felületi plazmonok
 Kitekintés
Bevezető
 Optikai csipesz (lézercsipesz)
 1970 Arthur Ashkin1 : 10-10.000 nm (baktériumok, vírusok) csapdázása
 1986 Steven Chu2 : atomok magneto-optikai csapdázása és hűtése, Nobel-
díj
 pN nagyságrendű erők alkalmazása és mérése
 Elmozdulás mérése nm pontossággal
 Legújabb technológiák: optikai alapú sejtszétválasztás,
plazmon erősítés, stb.
Az optikai csapdázás elméleti alapjai: sugároptika (a>>λ)
 Optikai csapda: nagy NA lencsével lézernyaláb
erősen lefókuszálva
 Dielektromos részecskére a fókusz közelében erő
hat a beeső fotonok impulzusátadása révén
 n>nm eset, szórás és visszaverődés
 Csapdázás feltétele: max Frefraction>Freflection
Rayleigh- szórás pontszerű dipólusra (a<<λ)
A mérőberendezés felépítése
• Csapdázó lézer
• Nyalábtágító
• A Gauss-nyaláb dereka kitölti a mikroszkóp objektívet
• Irányító optika
• Fókusz helye és rugalmassága
• Pozíció- és erőmérés
• Manuális fókuszálás
• Mikroszkóp
• Pozíció detektor
• CCD kamera
• Dikroikus tükrök
• Lézerfényt visszaverik, a megvilágítást
áteresztik
• Piezoelektromos mozgató
• Mintatartó mozgatása a fix csapdához
képest
Csapdázó lézer
• Általában Gauss TEM00 módus
• Jó pontstabilitás, kis teljesítményingadozás
• Teljesítmény: kb. ~1pN/10mW csapdázásnál (mikronos beadekre)
• Hullámhossz
• Minta átlátszósága (pl. biológiai minták NIR)
• Abszorpció -> melegedés -> minta roncsolódása
Objektív
• NA és a transzmisszió számít
• Immerziós olajba merítik általában ->kicsi munkatávolság (~0.1mm)
• Szférikus aberrációk arányosak a törésmutató eltéréssel az olaj és a
vizes csapdázó közeg között
• Nagy NA -> nagy intenzitásgradiens, de kisebb munkatávolság
• Kettős objektív elrendezés: 1:1 teleszkóp T2 transzmisszió
Pozíció detektálás
• Pozíció- és erőmérés kalibrációja gömb alakú mintával
• Többféle eljárás
• Videó alapú detektálás
• Kvadráns fotodióda
• Lézeres detektálás
• Egy vagy két lézerrel
• Polarizációs mérés, QPD detektoros mérés
• Axiális pozíció detektálása
• Mintán szórt lézerfény detektálása egy túltöltött fotodiódával
•Előreszórt és nem szóródó fotonok interferenciájával –
intenzitásmérés a kondenzorlencse hátsó fókuszsíkján
Dinamikus pozícióváltoztatás I.
• Dinamikus fókuszváltoztatás
• Brown mozgás relaxációjánál gyorsabb
vezérlés kell
• Pásztázó tükrök
• 1-2kHz, 100µs válaszidő
• Nagy szögeltérítés lehetséges
• Akkusztooptikai eltérítők
• TeO2 kristály
• Akkusztikus „optikai rács”
• Gyors válasz (foltméret/hangsebesség)
• 1D eltérítés, 2 AOD: 2D
• Intenzitásvesztés
• Elektrooptikai eltérítők
• Feszültség -> törésmutató változás
• Drága
Dinamikus pozícióváltoztatás II.
• Holografikus optikai csapda
• Több csapda egyidejű létrehozása
• Piezzoelektromos mozgató
• Mintatér mozgatása
• Gyors 3D pozícionálás
• Erő-visszacsatoló kör: konstans erő →pozícionálás
Videó detektálás
• CCD kamerával ismert méretű minta vizsgálata
• Pixelméret kalibrálása távolságra
• ~5nm pontosság
• Valós idejű képfeldolgozás
• Mintavételezés ~15-120 Hz
• CMOS kamera nagy frekvencián is működik (40kHz), de
a számítógép sebessége korlátozó tényező
• Nem megfelelő eljárás a fókuszhoz képesti relatív pozíció
(erőmérés) meghatározására
Kvadráns fotodióda
• A csapdázott objektumot egy kvadráns fotodiódára képezik
• Az egyes szegmensek közti különbségi jelet mérve (teljes
intenzitással normálva) a pozíció meghatározható
• Kis látótér, a csapda jó leképezése szükséges
• Nagy nagyítást igényel
Pozíció kalibráció I.
• Bead kalibrált mozgatása -> detektor jelének kalibrálása
• Piezzo mozgatóval, rögzített beaddel
• Előny: teljes 3D kalibráció
• Hátrány:
• Felesleges és hosszadalmas, ha csak 1
laterális irányban alkalmazunk erőt.
• Nem lehet teljes rögzítést
megvalósítani: sokaságátlag kell
• Ha csak laterális elmozdulás kell, akkor
is érdemes axiális irányban is kalibrálni,
mert a fókusz pontossága <~100nm
Pozíció kalibráció II.
• Csapdázott beaddel, a fókusz kalibrált változtatásával
• Fókusz kalibráció: CCD kamerával felvett
csapdázott beaddel
• Képalkotó pozíció detektorral, vagy 2 lézerrel
mérünk pozíciót
• Előny: Tetszőleges alakú objektumra
kalibrálható és a kalibráció és a
pozíciódetektálás egyazon pontban érvényes
(fókusz)
• Detektáló lézer előnye: külön fókuszálható a
csapda helyére (fókusz mögött) -érzékenyebb
a pozícióváltozásra, mint a csapdázó lézer
fókusza
• Hátrány: csak laterális
irányú kalibráció (axiális
merevség kisebb)
Axiális pozíciómérés és fókuszsík eltolódás
• Biológiai alkalmazásoknál fontos: egyik
molekula a felszínhez tapadva, a másik a
fókuszban -> távolság
• Fókusz axiális eltolódása a határfelületen való
törés miatt : Snellius-Descartes és a kísérlet sem
jó nagy NA lencséknél.
• Régen: fluoreszcencia méréssel
(evaneszcens hullámmal indukált), vagy
hidrodinamikai súrlódásméréssel (faleffektus)
• A maximumok között elméleti
illesztés
• A maximum jó kalibrációs
pont. Innen elmozdítva a piezo
• Pozíciódetektor teljes összegjele (PSD, vagy mintatartót, az abszolút távolság
kalibrálható.
QPD) arányos a teljes átjutó intenzitással
• Fókuszsík eltolódás mérése:
• Amikor a bead áthalad a fókuszon: 180°-os
• Hidrosztatikus közegellenállás
fázistolás
• Interferencia mérés
Erő kalibráció, merevség meghatározás
Erő kalibráció direkt fényintenzitás méréssel
Alkalmazások: Transzkripció vizsgálata
• RNS polimeráz a DNS láncon halad végig
• Transzkripció: DNS szekvencia másolása, messenger
RNS (mRNS) szintetizálása
• A DNS egyik vége a felszínhez kötve, az enzim a
beadhez
• Polarizációs interferometrikus pozíciódetektálás
• A beadet a csapda fix pontján tartják → az erővektor a
mérés során konst. → DNS lánc feszítése
• A transzkripció sebessége 25pN erőig független a
feszítettségtől
• RNS polimeráz erős molekuláris motor
• A piezo mozgatásával → a transzkripció időbeli lefutása
•~1 sec-os szünetek és állandó sebességű
periódusok
Egymolekulás nyújtás nukleinsavakon
• DNS replikációnál a bázispárok olvasása →
kettős spirál felbontása (dsDNS → ssDNS = helixcoil átmenet)
• Motiváció:
• DNS-fehérje kölcsönhatás vizsgálata
• Sok fehérje a DNS-hez kötődik és
megváltoztatja annak stabilitását
• Helix-coil átmenet energiája változik
(mérhető)
• DNS-hez kötődő gyógyszerek nyomon
követése, gyógyszerfejlesztés
• Pl. rák elleni gyógyszerek
• Különböző gyógyszerek
megkülönböztethetők az átmenet
mérésével.
Nyújtási kísérlet:
• dsDNS nehezen nyújtható
• Túlnyújtás:
• DNS egyik vége szabadon foroghat
• átalakulás kb. konstans erő mellett
• „Erő-indukált olvadás” –modell
(egyensúlyi fázisátalakulás)
• Nagyobb erőknél nemegyensúlyi,
irreverzibilis átalakulás (függ az erő
teljesítményétől is)
• Bezárt terület: fázisátalakulás
szabadenergiájának mérése (ΔG(T))
Bizonyítékok az olvadás-modellre
• Átalakulás közben konstans erő
• Az oldószer tulajdonságai erősen befolyásolják az átalakuláshoz
tartozó erő nagyságát
• Hőmérséklet
• pH
• Extrém pH értékeknél lecsökken az olvadáspont
• Bázispárok olvadáspontja
• Poly(dG*dC)Poly(dG*dC) 30pN-al magasabb átalakulási
erő, mint a Poly(dA*dT)Poly(dA*dT)
• Összhangban az olvadáspontokkal
RNS hajtű kibontása
• Bázispárokkal párhuzamos irányú húzóerő
(ellentétben a túlnyújtásos kísérlettel)
• Kb. 15 pN erő szükséges
• Az átalakuláshoz szükséges szabadenergia
azonos
• Meghatározható a nyújtáshoz szükséges
hossz mindkét esetben
• Túlnyújtás: x=0,24nm
• Kibontás: x=0,82nm
• Erők arányának becslése:
∆𝐺
𝐹𝑘𝑖𝑏𝑜𝑛𝑡
𝑥
= 𝑘𝑖𝑏𝑜𝑛𝑡 ≈ 0.3
∆𝐺
𝐹𝑡ú𝑙𝑛𝑦ú𝑗𝑡
𝑥𝑡ú𝑙𝑛𝑦ú𝑗𝑡
• F=20pN
• Jó egyezés a kísérlettel
• Lassú húzásnál a kibomláskor és a
relaxáláskor mért erő azonos volt ->
reverzibilitás
Források
• 1 Ashkin, A. (1970). "Acceleration and Trapping of Particles by Radiation
Pressure". Phys. Rev. Lett. 24 (4): 156–159.