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アイスプラントのリン酸輸送体
プロモーター領域の単離
41328 中俣浩介
指導教官 是枝晋
CAM型代謝経路
Night
CO2
Day
vacuole
PEP
CO2
Malate
Pyruvate
G6P Pi
GPT
G6P Pi
Pi G6P
GPT
Pi G6P
3-PGA
Starch
Calvin
F6P
chloroplast
cycle
RUBP
背景
• アイスプラントは塩ストレスによって代謝
経路がC3型からCAM型に変わる
• GPTの遺伝子GPT2はCAM化によって
発現が誘導される
目的
• GPT2のプロモーター解析を行い、CAM化
を発現レベルで制御するメカニズムを解明
するためにGPT2上流領域を単離
主な実験方法
• 葉からゲノムDNAを抽出
• ゲノミックサザンハイブリダイゼーション
• イントロンの配列決定
• インバースPCRによる上流領域の増幅
ゲノミックサザンの方法と結果
GPT2 cDNA
1
500
1000
1500
kb
23
15
9.4
ORF
800bp
プローブに使用したDNA断片
• GPT2はシングルコピーである
• 単離に適したGPT2断片を生じる制限
酵素を同定することはできなかった
GPT2の構造
1
500
1000
Sac I
アイスプラント
1500
2000
EcoR I
Pst I
Sac I Hind III
2500
Xba I
アラビドプシス
Sac I
EcoR I
Hind III
Pst I
Xba I
exon
intron
を用いてゲノムDNAを切断、インバースPCR
インバースPCRによる上流領域の増幅
ゲノムDNA
上流領域（未知）
GPT2（既知）
制限酵素処理
1回目のPCR
セルフライゲーション
2回目のPCR
(nested PCR)
インバースPCRの結果
kb
1.3
1.0
0.7
まとめ
• GPT2はシングルコピーである。
• アイスプラントとアラビドプシスのGPT2はイ
ントロンの位置が保存されている。このこと
はイントロンが二種の分化以前から存在し
ていたことを示唆する。
• GPT2の上流領域を含むと思われるDNA断
片を単離した。塩基配列を確認中。