Transcript JEL ELEKTROFOREZİ SDS-PAGE

JEL ELEKTROFOREZİ
SDS-PAGE
13.04.2015
FFMBG103
JEL ELEKTROFOREZİ





Büyüklük, yük ve konformasyon bakımından
birbirlerinden farklılık gösteren yüklü makromolekülleri
(protein, nükleik asit) iyonik bir ortamda birbirinden
ayırtetmek için kullanılır.
Protein yada DNA/RNA elektriksel bir ortamda
makromolekülün yükü ile doğru orantılı ancak şekli ve
büyüklüğü ile ters orantılı bir hızda hareket ederler.
Aminoasit, peptit, nukleotit, nukleik asit; yüklü moleküller
Net yüke göre elektriksel ortamda hareket, ya pozitif
(anot) ya da negatif (katot) kutuba
DNA/RNA fosfat grupları nedeni ile sabit – yüklü olup
pozitif elektroda doğru hareket ederler
13.04.2015
Bir partikülün göç oranını etkileyen faktörler
 Elektriksel alan gücüne
 Partikülün net yüküne
 Elektroforez ortamının yoğunluğu
13.04.2015
Elektroforez tipleri

Poliakrilamit jel elektroforezi (PAGE): proteinler ve DNA sekans analizinde 500 bç
nin altındaki nükleik asitleri ayrılabilir
1.
Native PAGE
2.
Native Gradient PAGE
3.
Urea PAGE
4.
SDS PAGE
5.
SDS Gradient PAGE
6.
IEF
7.
2D PAGE
8.


Western Blot
Agaroz jel elektroforezi: 50 kb a kadar büyüklükteki nükleik asitlerin ayırt edilmesi
Pulse field Jel elektoforezi: 10 Mb a kadar büyüklükteki moleküllerin ayırımı
13.04.2015
PAGE’in kullanım alanları






Araştırmalarda sıklıkla kullanılır
Protein ve nükleik asitlerin saflıklarının kontrolü
Oligonukleotit sekans analizi
Proteinlerin molekül ağırlıklarının ve izoelektrik pH larının
belirlenmesi
Protein ve enzim eldesi
Western blotlama
13.04.2015
PAGE





Poliakrilamit-matriks
Akrilamid- ana gövdeyi oluşturur
N,N metilen bisakrilamit- çapraz bağlanmalardan
sorumludur
N,N,N’,N’tetrametiletilendiamin (TEMED)- katalizör
Amonyum persülfat (APS)- radikal oluşumupolimerizasyonnun başlaması
13.04.2015


SDS-PAGE- Proteinlerin denatüre edildikleri sistem
NATIVE PAGE- Proteinlerin denatüre edilmeden
doğal halleriyle analiz edildikleri sistem
13.04.2015
Proteinlerin denatürasyonu neden
gereklidir?
Molekülün büyüklüğü ve üç
boyutlu yapısı bulunduğu
ortamdaki hareketini etkiler
 Aynı büyüklükteki protein
molekülünün ikincil, üçüncül ve
dördüncül yapılarının kaldırılması
aynı hızda hareketini sağlar
 Deterjan kullanımı-DenatürasyonSDS
Hidrofobik etkileşimleri çözer,
negatif yükü nedeniyle protein
yapısına negatif yük katar

13.04.2015

SDS yapısı
SDS öncesi
Yüklü R grupları
Hidrofobik alanlar
Proteinlerin üç boyutlu
yapısını kırar
Protein-lineer yapı ve
negatif yük kazanır

SDS sonrası
Eğer proteinler denatüre edilip elektriksel ortama bırakılırsa proteinlerin hepsi aynı hızda,
13.04.2015
büyüklüklerine bakılmaksızın pozitif kutba doğru hareket edeceklerdir
Sorun: Farklı büyükkükteki proteinleri aynı
ortamda nasıl farklı hızda yürütebiliriz?
Poliakrilamit ortam
Akrilamit/bisakrilamit: 19/1 maksimum çapraz
bağlama

Polimerizasyon ve çapraz
bağlanma. Akrilamit/bisakrilamit oranı ve her
iki bileşenin toplam konsantrasyonu finalde
ortaya çıkan jel matriksin por büyüklüğünü, ve
katılığını etkiler. Bu ise yürüyecek proteinlerin
hızını etkiler
13.04.2015
SDS-PAGE







Vakit alıcıdır
Oksijen varlığı polimerizasyonu engeller, bu sebeple cam
plakalar arasına dökülür
Gözenek oluşumu kimyasal bir işlem olduğundan çok düzenli
ve tek tip gözenek büyüklüğünde matriks oluşturulur
Gözenek büyüklüğü kullanılan akrilamid miktarı ile ters
orantılıdır. 7% poliakrilait jel %12 lik olandan daha büyük
gözenek içerir
Akrilamit nörotoksiktir
Polimerleşince tehlike arzetmez
Çok sayıda çapraz zincirler ve dallanmalar küçük
moleküllerin daha hızlı hareketini sağlar
13.04.2015
Kullanılan tampon
Yürütme tamponu
Jel içerisinde ve elektroforez tankında istenilen
değerde pH değerinin sabitlenmesini sağlar
. Tris-glisin-SDS tamponu
0.025MTris,0.192MGlisin,%0.1SDS,pH8.3
Bu tampon sistemi bir poliakrilamit matrikste moleküler
ağ etkisiyle denatüre protein-SDS kompleksini ayırır.
Matrisin por büyüklüğü proteinlerin ayrılma
etkinliğini belirler ve proteinlerin moleküler
ağırlığına bağlıdır

13.04.2015
Poliakrilamid jel birbirinden belli uzaklıkta (0,5-2,0 mm)tutulan iki cam
tabaka arasında ve genelde 8-10 cm ya da 10-10 cm boyutunda
hazırlanır.DNA dizileme çalışmalarında daha çok 20-40 cm boyutunda
hazırlanır.
 Polimerizasyon sırasında jelin üst kısmına yerleştirilen plastik bir tarak
jelde küçük kuyucukların oluşumunu sağlar .Polimerizasyondan sonra
tarak çıkarılır,kuyucuklar tuzları ve polimerize olmamış akrilamidi yok
etmek üzere tamponla yıkanır.
 Jel kaseti iki tampon arasına yerleştirilir;kuyucuklara örnekler konulur
ve akım geçirilir.
 Elektroforez bitiminde görüntüleme için jel uygun boya ile
boyanır.

13.04.2015
Jelin hazırlanması ve dökümü
Kuyucuklar
İstifleme
jeli
Ayırma
(koşturma)
jeli
Tampon
13.04.2015
Koşturma jeli (tamponu 1.5MTris-Cl,pH8.8)





Toplam jelin ¾’ünü oluşturur
Elektroforez sırasında separasyonun sağlandığı kısım
Gözenekli bir yapıdadır
Jelde gözeneklerin büyüklüğü jeli oluşturmak için
birbirlerine çapraz bağlarla bağlanan akrilamid
monomerlerinin konsantrasyonu ile ilgilidir.
% Akrilamid & örnek moleküler ağırlığına göre
belirlenir
13.04.2015
Por büyüklüğü ve akrilamid konsantrasyonuna göre
proteinlerin ayrılmaları
13.04.2015
İstifleme (yükleme) jeli (tamponu 0.5 M TrisCl,pH6.8)

Separasyon jeli polimerleşince onun üzerine dökülür
ve hemen ardından üzerine tarak yerleştirilerek
örnek kuyucukları oluşturulur
13.04.2015
Örnek hazırlığı ve jele yükleme




Protein izolasyonu
Konsantrasyonunun belirlenmesi
Örneklerin denatürasyonu: örnek tamponu ile
karıştırmak; 95 oC’de 5-10 dak. İnkübasyon
Yükleme (örnek tamponu) : 0.125M Tris, %4 SDS,
%20 Gliserol, %10 β-merkaptoetanol,
Bromophenol blue
13.04.2015
Camların %70 lik alkol ve saf su ile temzilendikten
sonra düzeneğe yerleştirilmesi ve jellerin dökülmesi
tarağın yerleştirilmesi
13.04.2015
Örneği denatüre etme, jeli tanka
yerleştirme
13.04.2015
Örnek yükleme, düzeneğin
tamamlanması
13.04.2015
Koşturma-boyama-yıkama
13.04.2015
Jellerin boyanması
Coomassie Blue boyama
Coomassie R: Jel üzerinde yaklaşık 100 ng proteini
tespit edebilir
Coomassie G: 10 ng proteini tespit edebilir
 Floresan boyalar
 Spesifik, 1 ng dan daha az proteinleri tespit
edebilir, nükleik asitleri boyamaz
 Silver staining (gümüş boyama): Hassas bir teknik,
 Proteinlerin jel matriksine tespiti, gümüş iyonlarının
13.04.2015
proteinlere bağlanması, formamid ileredüksiyon,

13.04.2015
13.04.2015
Protein büyüklüklerinin
hesaplanması
Rf (hareket)
13.04.2015
Protein büyüklüklerinin
hesaplanması

Her bir Standart bandın ilerleme yolu yükleme
boyasının gittiği yolun uzunluğuna bölünür: Rf değeri
13.04.2015
Kaynakça





B429 Moleküler Biyolojide temel teknikler
uygulama klavuzu ( Doç Dr. Özlem Osmanağaoğlu,
Araş. Gör. Fatma Kıran
http://www.tulane.edu/~wiser/methods/homework
/HW5_key.pdf
http://radio.cuci.udg.mx/bch/EN/SDS.html
webgentech.org/uploads/protocol/tr/sds.pdf
tip.kocaeli.edu.tr/docs/tibbi.../laboratuvarIII.doc
13.04.2015