Transcript Moleküler Ağırlığı Tayini

ÇEVRE BİYOTEKNOLOJİSİ DERSİ
PROTEİNLERİN DENATÜRE JEL ELEKTROFOREZİ İLE
AYRILMASI VE MOLEKÜLER AĞIRLIKLARININ
TAYİNİ
1
ELEKTROFOREZ
 Proteinler,
elektrik
yükü,
büyüklük, şekil gibi özelliklerine
göre ayrılırlar.
 Elektroforez
işleminde,
ortam
pH’sına göre, (+) ya da (-) olarak
yüklenen kolloid taneciklerin, bir
elektrik
alanında,
kendi
net
yüklerine zıt yük taşıyan anot
veya katoda doğru farklı hızlarda
sürüklenmeleri.
2
ELEKTROFORETİK YÖNTEMLER
 Karışım içinde bulunan protein sayısını tespit
etmek( kağıt ve jel elektroforezi)
 Saflaştırılmış proteinin saflık derecesini belirlemek
( SDS-PAGE)
 Saflaştırılmış proteinin molekül ağırlığını tayin etmek
(SDS-PAGE) amacıyla kullanılır.
3
SDS - PAGE
 SDS:Sodyum Dodesil Sülfat-anyonik deterjan
(-) yüklü SDS, proteinlerin kuarterner, tersiyer ve
sekonder yapılarını bozar, katları açılan peptid zincir,
SDS ile sarılarak misel görünümü kazanır.
Zincirde yer alan her 2 AA artığına 1 molekül SDS
bağlanır ve proteinlerin hepsi (-) yüklenir
4
POLİAKRİLAMİD JEL
Proteinlerin ayrılmasında en çok kullanılan destek matriksi olan
poliakrilamid, porlu bir jel ortaya koyar. Bu jel, filtre gibi işlev görür ve
küçük moleküllerin sebestçe hareketine izin verirken daha büyük
makromoleküllerin geçişini kısıtlar.
Belli por büyüklüğünde bir jel hazırlayarak proteinlerin molekül
büyüklüğüne göre ayırmak mümkündür.
5
Por Büyüklüğünün Belirlenmesi
Poliakrilamid jelin oluşumunda, “akrilamid” monomerleri bir çapraz bağlayıcı yardımı ile
kovalent olarak bağlayan uzun zincirlere polimerize olur. Yapıyı birarada tutan esas bileşen
çapraz-bağlayıcı, (cross-linker) dir. En yaygın olarak kullanılan çapraz bağlayıcı, kısaca bis adı
verilen “N,N’-metilen-bis akrilamid” dir. Akrilamid jelde por büyüklüğü, akrilamid ve bis
içeriğini ifade eden % T ve % Cbis terimleri ile belirlenir. % T, total akrilamid %’si (w/v), %
Cbis ise bis’in monomere oranı (w/w) olup aşağıdaki formüllere göre hesaplanır.
Akrilamid (g) + Bis (g)
%T =
x 100
Hacim (ml)
Bis (g)
% Cbis
=
x 100
Akrilamid (g) + Bis (g)
Bu formüllere göre, % 20 T ve % 5 Cbis içeren bir jelde % 20 (akrilamid +bis) ve total
akrilamidin % 5’i oranında bis bulunur. % T arttıkça por çapı küçülür.
6
Elektoroforezde Kullanılan Tampon Sistemleri
 Elektroforezde göç hızı proteinin net yüküne bağlı olduğundan,
hızı sabit tutabilmek için, çözeltinin pH’ını sabit tutmak gerekir. Bu
nedenle elektroforezde çeşitli tampon çözeltiler kullanılır.
 Elektroforezde kesiksiz ve kesikli olmak üzere 2 tampon sistemi
kullanılır.
 Kesiksiz sistemde tek bir ayırıcı jel vardır, tanklarda ve jelde
aynı tampon kullanılır.
 Kesikli sistemde ise, farklı tamponlarda hazırlanmış iki jel
kullanılır.
I. Seçici olmayan, büyük porlu bir jel: Yükleme jeli
(stacking jel)
II. Daha selektif, küçük porlu bir jel: Ayırma jeli
(seperating jel).
7
Stok Çözeltiler
Monomer
Tampon
% 10 SDS
H2O
TEMED
APS
Örnek uygulama tamponu
Tank tamponu
Boya çözeltisi
Fazla boyayı alma çözeltisi
Su ile doyurulmuş n-butanol çözeltisi
8
Jellerin Hazırlanması
9
Protein Örneklerinin Hazırlanması
10
Yükleme ve Elektroforez İşlemi
11
Jelin Analizi
Elektroforetik
ayırım
bittikten
sonra
jel,
aşağıdaki
işlemlerden birisi ile analiz edilir.
Boyama (Coomassie Blue veya gümüş boyama)
Otoradyografiyi takiben densitometri
Elektroforez
ile
(elektroblotting)
hibridizasyonu,
ve
bir
daha
otoradyografi,
membrana
sonra
nakletme
nükleik
immunodeteksiyon
asit
gibi
teknikler uygulanır.
12
Jellerin Boyanması
13
Jellerin Boyanması
14
Moleküler Ağırlığı Tayini
Molekül ağırlığı bilinmeyen protein örneği, molekül ağırlığı bilinen standart
proteinlerle birlikte, aynı jel üzerinde yanyana elektroforetik olarak ayrılır.
Boyama sonrasında jelde gözlenen bantların karşılaştırılması ile proteinin molekül
ağırlığı hakkında bir fikir elde edinilebilir. Ayrıca bu tip bir ayrışımın sonuçlarını
matematiksel olarak değerlendirmek de olasıdır. Jeldeki göç hızının bir
fonksiyonu olan relatif göç hızı (Rf değeri), jelin üst kısmından bandın bulunduğu
yere kadar olan uzaklığın, jelin üst kısmından işaret boyasının olduğu yere kadar
olan uzaklığa oranıdır.
Polipeptidin molekül ağırlığının logaritması ile Rf değeri arasında doğrusal ilişki
vardır. Dolayısı ile standart polipeptidlerin Rf değerleri (ordinata) ve molekül
ağırlığının log10 değerleri (absise) yerleştirilerek bir standart grafik hazırlanır.
Molekül ağırlığı bilinmeyen proteinin Rf değeri bulunur ve grafikte bu değere
karşılık gelen noktadan aşağıya bir dik indirilerek molekül ağırlığının logaritmik
değeri belirlenir. Bu değerin antilogaritması moleküler ağırlığını verir.
15
Moleküler Ağırlığı Tayini
Yükleme jeli (boyama sırasında kopabilir)
Ayırma jeli
X
A
Y
x (cm)
A bandı için Rf =
y (cm)
İşaret boyasına ait bant
16
Moleküler Ağırlığı Tayini
Standart nümune
Molekül ağ.(log)
nümune
protein
Sürüklenme hızı
17
Moleküler Ağırlığı Tayini









18
19