Transcript Poglavlje 13.2 Kromatografija

13.2.KROMATOGRAFIJA
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Kromatografiju je izumio ruski
botaničar Tswett (Cvet) početkom
20. st.
Primijenio je kromatografsku
tehniku za odjeljivanje otopine
biljnih pigmenata klorofila i
ksantofila prolaskom kroz staklenu
kolonu napunjenu usitnjenim Cakarbonatom.
Odjeljeni sastojci vide se na koloni
kao obojene vrpce po kojima je ta
tehnika dobila ime (grč. Chroma =
boja)
Odjel za kemiju
13.2.1. KROMATOGRAFSKE METODE
Definicija i osnovni pojmovi
Kromatografija je fizikalna metoda koja se koristi za razdvajanje
smjesa kojom se sastojci koji se razdvajaju raspodjeljuju
između dvije faze:
•
•
nepokretne ili stacionarne faze (stationary phase, adsorbent, SP)
pokretne ili mobilne faze (mobile phase, eluent, MP)
 Stacionarna faza: kruta, tekuća (vezana na čvrstom nosaču), gel
 Mobilna faza
 plinovita: plinska kromatografija (gas chromatography, GC),
 tekuća: tekućinska kromatografija (liquid chromatography, LC)
Odjel za kemiju
 Kromatografska kolona: cijev koja sadrži stacionarnu fazu i kroz koju
prolazi mobilna faza.
 Kromatograf: uređaj za izvođenje kromatografskih razdvajanja
 Kromatogram: grafički prikaz odziva detektora (kromatografske
analize)
Odjel za kemiju
13.2.1.1. PODJELA KROMATOGRAFSKIH
METODA
•
Plošna kromatografija
– stacionarna faza nanesena je na ravnu plohu ili u
pore papira. Mobilna faza prolazi kroz stacionarnu
zbog kapilarnih sila ili gravitacije
•
Kromatografija na stupcu
– stacionarna faza ispunjava usku cijev kroz koju se
mobilna faza kreće pod utjecajem tlaka ili
gravitacije
Mobilna faza
tekućina
plin
superkritični fluid
Odjel za kemiju
PODJELA PREMA AGREGATNOM STANJU FAZA:
stacionarna faza
mobilna faza
krutina
tekućina
tekućina (tanki film
otapala na tankom
krutom poroznom nosaču
plin
mobilna faza
stacionarna faza
postupak
tekućina (liquid, l)
tekućina (liquid, l)
krutina (solid, s)
tekućina (liquid, l)
LSC
LLC
plin (gas, g)
plin (gas, g)
krutina (solid, s)
tekućina (liquid, l)
GSC
GLC
Odjel za kemiju
PODJELA PREMA FIZIČKO – KEMIJSKIM SVOJSTVIMA ANALITA
mobilna faza: plin
(plinska kromatografija)
mobilna faza: tekućina
(tekućinska
kromatografija)
Sve vrste GC
_
adsorpcija
GSC
LSC
topljivost
GLC
LLC
GSC s molek. sitima
gelna kromatografija
afinitetna kromatografija
GLC uz tvorbu kompleksa
kromatografija ionske
izmjene
svojstvo analita
vrelište
oblik molekule
reverzibilna kemijska
reakcija
Odjel za kemiju
PODJELA PREMA IZVEDBENIM TEHNIKAMA:
Odjel za kemiju
Kromatografija na papiru
PC
Kolonska kromatografija
CC
Plinska kromatografija
GC
Tankoslojna kromatografija
TLC
Tekućinska kromatografija
visoke razlučivosti
HPLC
Odjel za kemiju
13.2.2. Kromatografska analiza:
1. Unošenje (injektiranje) analita
 unošenje uzorka u mobilnu fazu
2. Razdvajanje analita u koloni
 sastojci iz analita razdvajaju se u koloni na temelju različite
raspodjele između dviju faza
3. Eluacija (ispiranje) komponenti iz kolone
 različiti sastojci izlaze iz kolone u različitim vremenima
4. Detekcija
 eluirane komponente obično se analiziraju mjerenjem neke
od fizikalnih svojstava komponente (indeks refrakcije, UV
apsorpcija, električna vodljivost …)
Odjel za kemiju
a) TEKUĆINSKA KROMATOGRAFIJA (LC)
•
•
Eluacija – ispiranje sastojaka koji prolaze kroz kolonu dodavanjem novih
količina otapala.
Ako je stacionarna faza polarna onda se za mobilnu uzima nepolarna.
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Raspodjela analita između faza
Analit se nalazi u ravnoteži između dvije faze:
Amobile
⇋
Astationary
Konstanta ravnoteže K te reakcije zove se koeficijent raspodjele:
K 
cS
cM
 cS … molarna analitička koncentracija sastojka u stacionarnoj
fazi,
 cM … molarna analitička koncentracija sastojka u mobilnoj fazi.
Odjel za kemiju
Vrijeme zadržavanja (retention time) tR
- vrijeme potrebno da analit nakon unošenja uzorka stigne u detektor
Mrtvo vrijeme tM
- vrijeme potrebno da mobilna faza prođe kroz kolonu
Odjel za kemiju
k
'
A

tR  tM
..... Faktor kapaciteta (faktor zadržavanja)
tM
(retention factor, capacity factor)
 za k'A znatno manje od 1  eluiranje je prebrzo, tR teško
mjerljivo,
 za k'A > 20-30 
eluiranje je predugo,
 k'A 1 – 5  idealno
Odjel za kemiju
b) KOLONSKA KROMATOGRAFIJA (CC)
Tiselius – začetnik kolonske kromatografije 1952.
a) punjene kolone
 materijal: čelik, staklo, teflon
 duljina: 2-3 m, unutarnji promjer: 2-4 mm
 punjenje: čvrsti nosač (obično dijatomejska zemlja) na kojem je
nanesen tanki sloj stacionarne (tekuće) faze
b) kapilarne kolone
 materijal: danas uglavnom kvarcno staklo
 duljina: 10-100 m, unutarnji promjer: 0.1 - 0.5 mm
 punjenje: unutarnje stjenke prevučene samo slojem tekuće
stacionarne faze ili nosačem na kojem se nalazi adsorbirana
stacionarna faza
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
c) KROMATOGRAFIJA NA PAPIRU (PC)
Odjel za kemiju
Primjena PC:
-
identifikacija supstancija,
-
ispitivanje čistoće supstancija.
Osobine PC:
-
relativno brza metoda,
-
potrebna mala količina
materijala.
- stacionarna faza: visokokvalitetni filter papir
- mobilna faza: otopina razvijača
http://www.youtube.com/watch?v=EUn2skAAjHk
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
d) TANKOSLOJNA KROMATOGRAFIJA (TLC)
E. Stahl - začetnik tankoslojne kromatografije (TLC), 1950
Isti je pricip kao kod papirne kromatografije.
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Tankoslojna kromatografija
(Thin layer chromatography (TLC))
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
e) PLINSKA KROMATOGRAFIJA (GC)
Martin i James – začetnici plinske kromatografije (GC), 1952.
(Nobelova nagrada)
•
Mobilna faza: - inertni plin koji eluira komponente smjese u koloni
napunjenoj stacionarnom fazom.
- Za razliku od tekućinske kromatografije u plinskoj kromatografiji analit ne
reagira s mobilnom fazom te zbog toga njegova brzina kretanja kroz
kolonu ne ovisi o kemijskoj strukturi mobilne faze.
•
Stacionarna faza:
- za odjeljivanje komponenti male molekulske mase:
stacionarna faza je čvrsta tvar velike specifične površine na koju se
adsorbiraju analizirane komponente,
- za odjeljivanje komponenti velike molekulske mase:
stacionarna faza je tekuća faza nanesena na površinu čvrstog nosača
adsorpcijom ili kemijskim vezanjem.
Odjel za kemiju
Analit:
-
ubrizgava se kao tekućina koja zbog visoke temperature u
kromatografu prelazi u plinovito stanje,
-
temperatura ulaza instrumenta postavlja se na 50°C višu
temperaturu od temperature vrelišta najslabije hlapljive komponente
iz analizirane smjese.
Odjel za kemiju
Plinski kromatograf
Sastavni dijelovi aparata:
 Plin nosilac (carrier gas):
 kemijski inertan (N2 He, Ar, H2)
 regulirani protok plina
 Sustav za unošenje uzorka:
 količina uzorka: 0.1 – 20 μL
 mjesto unošenja uzorka je grijano (ca. 50°C iznad temp. vrelišta najmanje
hlapljivog sastojka
Odjel za kemiju
Faze plinsko-kromatografske analize:
 unošenje uzorka na vrh kolone,
 transport uzorka mobilnom fazom kroz kolonu,
 adsorpcija sastojaka u stacionarnoj fazi,
 detekcija sastojaka.
 http://www.wooster.edu/chemistry/analytical/gc/default.html
Odjel za kemiju
ECD
FID
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Plinska kromatografija
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Slika prikazuje sofisticirani plinski kromatografski sustav, koji bilježi
koncentraciju akrilonitrila u zraku.
Odjel za kemiju
f) TEKUĆINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE
DJELOTVORNOSTI (HPLC)
Odjel za kemiju
Mobilna faza:
Stacionarna faza:
Tlak:
tekućina
punila vrlo finih zrna
nekoliko milijuna Pa (do 4 x 107 Pa = 400 bara)
- tlačna pumpa, sisaljka
Podjela HPLC (High Performance Liquid Chromatography):
(1) Razdjelna kromatografija
(2) Adsorpcijska kromatografija
(3) Ionsko-izmjenjivačka kromatografija
(4) Kromatografija isključenjem na osnovi veličine čestica
(size-exclusion chromatography)
Doseg HPLC:
Odjel za kemiju
najveći u separacijskim tehnikama,
proizvodnja > mld USD godišnje
Prednosti HPLC:
- osjetljivost,
- prilagodljivost,
- analiza neisparljivih i termički osjetljivih spojeva,
- široki spektar uzoraka (industrija, znanost: aminokiseline,
nukleinske kiseline, šećeri, lijekovi, pesticidi, organometalni
spojevi, anorganske tvari i dr.)
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
• Shema HPLC uređaja
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
13.2.3. DETEKTORI
Efluent s kolone mješa se s vodikom i zrakom i spaljuje.
Organski sastojci sagorijevaju u plamenu stvarajući ione i elektrone koji
mogu provoditi elektricitet kroz plamen. Na vrh plamenika dovodi se
visoki električni potencijal, a iznad plamena postavljena je kolektorska
elektroda. Mjeri se električna struja izazvana pirolizom organskih
sastojaka.
Odjel za kemiju
DETEKTORI
• Ključni su dio HPLC-uređaja: stalno se usavršavaju
• Nema opće primjenljivih detektora (kao FID/TCD)
• Zahtjevi: kao kod GC; dodatno: što manji volumen uzorka
• Tipovi: (1) prate promjenu svojstava mobilne faze
(indeks loma, dielektrična konstanta i dr.),
(2) detektori analita (UV, fluorescencija...).
• Zastupljenost: 71% UV, 15% fluorescencijski, 5% indeks loma
Odjel za kemiju
13.2.3.1. UV/VIS-apsorpcijski detektori
• Svojstva: univerzalnost, jednostavnost, selektivnost, osjetljivost
- vrlo su rašireni
• Načelo: apsorpcija elektromagnetskog zračenja u UV-(170 - 400
nm) i VIS-području (400 - 750 nm)
• Lambert-Beerov zakon (za kvantitativnu primjenu):
A=Ɛ×b×c
• Tipični UV/VIS-detektor: volumen 1-10 μl, duljina 2-10 mm,
tlak < 40 bar (potrebni reduktori)
Odjel za kemiju
13.2.3.2. Detektori s filterima
-
Izvor zračenja: Hg-lučnica iz koje filtar izdvaja λ = 254 nm (odnosno 250, 313,
334 nm) - primjena ograničena.
Izvor zračenja: deuterijeva (D2) ili volframova (W) lampa s više filtera
(rotirajući) - za serijske analize uzoraka poznata sastava.
13.2.3.3. Detektori s monokromatorima
- Prizme ili optičke rešetke (grating) razdvajaju polikromatsko svjetlo na
komponente određenih valnih duljina koje se potom djelovanjem pukotine
odaberu prema uzorku da bi se snimio cijeli kromatogram.
Odjel za kemiju
Alternativa: za svaku komponentu uzorka (ako su dovoljne razlike tR)
odabire se najpogodnija λ, uz moguću kompjutorsku podršku
-
izvor D2-lučnica (190-800 nm), uz izdvajanje putem rešetke (grating)
snopova širokih 2-4 nm (starije naprave 20-40 nm)
13.2.3.4. Detektor s nizom dioda (Diode Array Detector)
Načelo: osvjetljivanje uzorka polikromatskim svjetlom (“bijelim”) D2-lučnice,
a potom disperzija optičkom rešetkom na snopove 2 nm koji
istodobno padaju na niz od cca 316 dioda
- Cijeli snimak (scan): 0,1 sekunda (u praksi nekoliko sekundi) uz odličnu
reproducibilnost.
Dobiva se i pohranjuje cijeli spektar svake komponente.
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
-
Mogućnost: 3-dimenzionalni graf A-λ-t za razdvojene steroide u
intervalu 5 sekundi
Odjel za kemiju
13.2.3.5. Fluorescencijski detektori
• Fluorescencija – neke tvari apsorbiraju elektromagnetsko zračenje i
pri relaksaciji (prelazak iz pobuđenog u osnovno stanje) emitiraju
zračenje više valne duljine λ (često u vidljivom dijelu spektra, VIS)
• Ograničeno na fluorescirajuće spojeve (farmacija, prirodni i klinički
spojevi,naftni derivati); moguća je pretvorba nefluorescirajućih u
fluorescirajuće spojeve!
• Izvori elektromagnetskog zračenja:
(1) Hg-lučnica (emitirano svjetlo izolira se s filtera)
(2) Xe-izvor (monokromatori su optičke rešetke)
• Emitirana svjetlost širi se u svim smjerovima pa je fotoelektrični
detektor pod 900 prema λ upadne zrake
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
13.2.3.6. Detektori za mjerenje indeksa loma
• Svojstva: pouzdanost, neovisnost o protoku, niska osjetljivost, ovisna
o temperaturi (opći uređaj poput FID)
• Načelo: prisutnost otopljene tvari (solute) mijenja indeks loma
mobilne faze (MF)
• Naprava: Diferencijalni detektor; u komoru odijeljenu staklenom
pločicom s jedne strane prolazi otapalo a s druge eluat.
Ploča uzrokuje lom ulazne zrake.
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju
Odjel za kemiju