Transcript 4- semra sertyel – embriyo gelişiminde kokültürün yeri
EMBRİYO GELİŞİMİNDE KOKÜLTÜRÜN YERİ Bio. Semra Sertyel
ALMAN HASTANESİ IVF LABORATUARLARI
YÜT’de başarıyı etkileyen faktörler Kadın yaşı Erkek Faktörü Uygun olmayan stimülasyon protokolleri Oosit matürasyonu Kromozomal ve/veya nükleer anomaliler Büyüme faktörü eksikliği Suboptimal kültür şartları
Embriyo Kültür Ortamı
Emriyo gelişimi hakkında bilgimiz her geçen gün artmasına rağmen, gelişen bir embriyo için gerekli ihtiyaçların tümünü karşılayabilen bir embriyo kültür ortamı henüz tanımlanamamıştır.
Ko Kültür
Döllenmiş gamet hücrelerinin embriyo transfer işlemine kadar olan süre içerisinde tek bir düzlemde çoğaltılarak kültüre edilen özel somatik hücreler ile aynı ortamda geliştirilmesidir. Önceki ART denemeleri konvansiyonel kültür ortamlarında gerçekleştirilmiş, TİB tanısı konmuş hasta grubuna ko kültür bir alternatif olarak sunulmaktadır.
(Simon C. 2000, Spandorfer 2002)
Ko kültür (Endikasyonlar
)
En az iki başarısız ART denemesi Gelişen embriyolarda belirgin yavaş gelişim izlenmesi (3.günde <6 blastomer ) Kötü Morfolojide embriyo gelişimi (düzensiz klivaj,uneven blastomer, yüksek fragmantasyon)
ÇALIŞMA MEKANİZMASI
Etki mekanizması henüz tam olarak açıklanamamıştır.
Ortamdaki potansiyel toksik maddelerin uzaklaştırılması Büyümeye yardımcı faktörlerin ortama salgılanması Toksik Maddeler Büyüme Faktörleri
Ko kültür Hücre Tipleri
Sheep oviduct epithelial cells (Bongso 1992, Gandolfi 1989 ) Bovine fibroblastic cells (Yeung 1992 , Wiemer 1989) Vero cells Human ampullary cells Human Granulosa cells Human endometrial cells (Menezo et al., 1990) (Lai et al.,1992) (Plachot 1993, Quinn 1996) (Barmat 1994, Liu 1995)
Endometriyal Ko kültür Cornell sonuçları
Endometriyal ko kültür üzerinde kültüre edilmiş embriyolarda daha düşük oranda fragmantasyon ve daha yüksek sayıda blastomer içerdikleri gözlenmiştir.
Barmat L.et al.(1998) İlk hücre pasajı dondurulmuş endometrial kokültür hücreleri çözme sonrası taze kültür kalitesini sürdürebilmektedirler Liu H.( 1999) Otolog endometrial kokültür hücreleri embriyo gelişimi için gerekli gelişim faktörlerinin salgılanmasının yanısıra otokrin ve parakrin düzenlemeler ile embriyo gelişim kalitesinin artmasını sağlamaktadırlar. Spandorfer S.D.(2002)
Endometriyal Ko kültür IVI sonuçları
İnsan embriyolarının endometrial kokültür üzerinde kültüre edilmesi güvenli, fizyolojik, etik ve etkili bir yöntemdir.
Simon C. et al.(1999) Kokültür üzerinde embriyo geliştirilmesi daha iyi embriyo gelişiminin sağlanması yönünden önemli bir tekniktir.
Simon C.et al.(2000) Tekrarlayan implantasyon başarısızlığı gözlenmiş hasta gurubunda yüksek gebelik ve normal perinatal sonuçların sağlanması kokültür uygulamaları ile mümkün olmuştur.
Simon C.(2003)
Neden otolog endometrial kokültür?
İmplantasyonu Arttırır Güvenlidir Dengelidir Kontrol Mekanizması sağlar Embriyo Gelişim Kalite ve Hızını etkiler
Neden otolog endometrial kokültür?
Güvenlidir
•
Hastanın kendi hücreleri ve serumu kullanıldığı için diğer sistemlerine göre daha güvenlidir (Spandorfer et al.-2002)
Neden otolog endometrial kokültür?
•
Dengelidir: Embriyo gelişimini destekleyen ve düzenleyen maddelerin, büyüme faktörleri ve sitokinlerin ortamda dengeli ve sürekli bulunmasını sağlar (Spanos et al.-2002 , Hung-Ching Liu et al-1999)
Neden otolog endometrial kokültür?
•
Kontrol Mekanizması sağlar: Ortam içerisinde antioksidan sistemler oluşturarak embriyo için zararlı olabilecek metabolik artıkların embryo çevresinden uzaklaştırılmasını sağlarlar (Bo Sun Joo et al.-2001)
Neden otolog endometrial kokültür?
•
İmplantasyonu Arttırır: Endometriyal hücrelerin embriyonik parakrin molekül salgılanması (
3 integrin) sonucu özellikle TİB hastalarında endometrial reseptivite arttırılır (De Los Santos et al.1998)
Neden otolog endometrial kokültür?
•
Embriyo Gelişim Kalite ve Hızını etkiler: TİB hastalarının 3. gün embryo gelişiminin PGT öncesi biyopsi kriterlerine daha uygun düzeye getirilmesi sağlanır
•
(Simon et al.1999-2000)
Dezavantajları
Laboratuar şartlarında yoğun iş gücü ve teknik donanım gerektirmesi Kontaminasyon riski Hücre kültürü konusunda eğitimli eleman Gerektirmesi Konvansiyonel kültür ortamlarına göre çok daha fazla zaman alması
Uygulama Grubu >38 ♀ yaş altı olgular Şiddetli erkek faktörü içermeyen olgular 5 MII üzeri oosit eldesi
Transfer Otolog Endometriyal Ko Kültür Strateji Biyopsi 6 5 4 1 3 2
Endometriy al Hücre vitalite ölçümü %4’lük trypan blue (%4) (Sigma t-8154) Ekim:300.000 canlı hücre/well
Otolog Endometriyal Ko Kültür Strateji
Stromal Hücreler Glandular Hücreler 300 000 vital hücre/well Nunc kültür kabı yüzeyi
EMBRİYO GELİŞİMİ
EMBRİYO GELİŞİMİ
Vimentin
AECC-Strategy
Cytokeratin
Endometriyal Ko Kültür
3.Günde <6 blastomer sayısı olan dondurulmuş-çözülmüş embriyolar kullanılmıştır (n=37) Grup A: Rutin kültür ortamı +20 µg/ml IGF-1 Grup B: Endometriyal stromal hücreleri+Ham’s F-10 +%10 MS Embriyo gelişimi 3.günden 6. güne kadar gözlenmiştir.
Hu Ching Liu et al., (1999)
Endometriyal Ko Kültür
Konvansiyonel Kültür Ortamı Endometriyal Ko kültür Blastosist oluşum oranı: %18,1 IGF ve receptör ekspresyonu %51,8 Hu Ching Liu et al., (1999)
Endometriyal Ko Kültür
%18 %68 %34 %14 %16 %20 %40 %12 Hu Ching Liu et al., (1999)
Ko kültür:Çalışma dizaynı
TİB olguları gebelikleri; kadın yaşı, önceki deneme sayısı ve elde edilmiş MII oosit sayı ortalamalarına göre ikiye ayrılarak değerlendirildi.
1.grup: Tüm denemeleri konvansiyonel kültür ortamında gerçekleştirildi (369) Önceki deneme ortalaması: 4,8 siklus 2.grup: Hastaların son denemeleri kokültürde gerçekleştirildi (389) Önceki deneme ortalaması: 3,3 siklus
50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 ♀Yaş Ortalamasına Göre Gebelik Sonuçları (%)
Kokültür-TİB
37.7
35.9
Konvansiyonel-TİB
p<0.05
30.4
28.9
21.8
13.7
20-30 30-38 38<
25 20 15 10 50 45 40 35 30 5 0 2 ART Deneme Sayısına Göre Gebelik Sonuçları (%)
Kokültür-TİB
44.1
Konvansiyonel-TİB
41.8
37.5
p<0.05
36.3
24.3
24.7
27.3
26.3
26.6
20 27.1
18 3 4 5 6 >6
80 Elde Edilen MII Oosit ortalamasına Göre Gebelik Sonuçları (%) Kokültür-TİB Konvansiyonel-TİB 70 p<0.05
60 53.2
50 37.8
40 30 30.3
29.1
40.4
35.9
20 13.6
10 8 0 <5 5-10 10-15 >15
SONUÇ
•
TİB olgularında tüm denemeleri konvansiyonel kültür ortamında gerçekleştirildiği takdirde gebelik ancak ortalama 4.8 deneme sonrası sağlanabilmektedir. Daha önce ortalama 3,3 başarısız konvansiyonel kültür denemesi olan grupta ise kokültür uygulaması sonrası gebelik elde etmek mümkün olmuştur.
SONUÇ
•
Önceki deneme sayı ortalamalarına, elde edilen MII oosit ortalaması ve kadın yaşına göre bu gebelikler incelendiğinde kokültür grubunun gebeliklerinin daha yüksek olduğunu görüyoruz.
SONUÇ
Tüm yaş gruplarında endometrial kokültür avantaj sağlamakla birlikte her iki grupta 38 yaş altında daha effektif başarı göstermektedir.
Açıklanamayan tekrarlayan implantasyon başarısızlığı olgularında endometriyal ko kültür uygulamaları embriyo kalitesini ve gebelik şansını arttırmaktadır.