Transcript Document

OVER DOKUSU VE OOSIT
KRIYOPRESERVASYONUNDA YENİ
STRATEJİLER
Bio. Semra Sertyel
ALMAN HASTANESİ
IVF LABORATUARLARI
Erken Over Yetmezliğinin Nedenleri
• Genetik
• Enfeksiyon
• Otoimmun
• İatrojenik
Dondurularak saklanan insan yumurtalık
dokusunun transplantasyonu ilk olarak
1999 yılında gerçekleştirilmiştir.
G, NEJM, 2000- Oktay K
Yumurtalık Dokusunun Dondurularak Saklanma Endikasyonları
Çocukluk ve gençlik çağı kanserleri
Üreme çağında görülen kanserler
Kemik iliği transplantasyonu olguları
Benign yumurtalık hastalıkları
Profilaktik ooferektomi
Yumurtalık Dokusunun Dondurularak Saklanma Endikasyonları
Çocukluk ve Gençlik Çağı Kanserleri
Lösemi
Lenfoma
Nöroblastoma
Osteosarkoma
Ewing’s Sarkoma
Rabdomyosarkoma
Wilm’s Tümörü
Üreme Çağında Görülen Kanserler
Meme Kanseri
Serviks Kanseri
Lösemi
Yumurtalık Dokusunun Dondurularak Saklanma Nedenleri
Çocukluk ve Gençlik Çağı Kanserleri
Lösemi
Lenfoma
Nöroblastoma
Osteosarkoma
Ewing’s Sarkoma
Rabdomyosarkoma
Wilm’s Tümörü
Üreme Çağında Görülen Kanserler
Meme Kanseri
Serviks Kanseri
Lösemi
Premature ovarian failure (POF)
Early pregnancy loss.
NASIL DONDURMALIYIZ ?
Kontrollü Yavaş Dondurması
Dokuların homojen dondurulması
Cryotoksisitinin daha düşük olması
Pahalı bir cihaza ihtiyaç duyulması
Zaman alıcı olması
Vitrifikasyon
Hızlı
Yüksek konsantrasyon CRP nedeni ile toksisite olasılığı
Dondurma aparatı üzerine bir konselsiyus sağlanamadı
Bu bu tekniğin uygulanması üzerine tecrübeler sınırlı
NASIL DONDURMALIYIZ ?
Medullar Removal
• Medulla kısmı çıkarılır
• Foliküller medulla-corteks sınırından çıkarılır
•Trimming gently
•No pressure or cuts on the cortical tissue
•Trimmed medullar tissue can be evaluated, digested and follicles can be isolated.
•In vitro maturation or cryopreservation can be performed on
isolated follicles.
Oktem et al Fertil Steril
Theriogenology, 2011
Better development after IVF was observed in the slow-freezing case than
in the vitrified case
Cryo Letters. 2009 Nov-Dec;30(6):449-54.
Cryobanking of human ovarian tissue for anti-cancer
treatment: comparison of vitrification and conventional
freezing.
Isachenko V, Isachenko E, Weiss JM, Todorov P, Kreienberg
For cryopreservation of human ovarian tissue, conventional freezing is
R.
more promising than vitrification
Vitrification seems more favorable than slow freezing…
Vitrification of human ovarian tissue: Effect
of different solutions and procedures
Jacquez Donmez et al.2011
3 ayrı vitrifikasyon sıvısı konfugurasyonu ve3 ayrı yükleme mekanizması tartışması
VS1
2M DMSO ve 0.1 M Sucrose(5 dak/RT)
2M DMSO,2M PROH
,0.2M sucrose(5 dak/RT) 0,5M (5 dak/RT)
VS2
7,5DMSO ve 7.5 EG to BS)(20 dak/RT)
%15 EG ve %15 DMSO to BS(3 dak /R
1.01M sucrose to SM (%20 FBS to
MEM-glutomax (3 dak/RT)
0,25 M sucrose TOBS (5 dak/RT)
0.5M sucrose to SM(5 min/RT)
0,125M sucrose to BS)(5dak/RT)
SM (10 dak/RT-2X)
BS(5 dak. /RT-3X)
Vitrification of human ovarian tissue: Effect
of different solutions and procedures
38% EG ve 0,5M trehalose to BS
(%6FBS to MEM-GlutaMAX) %10
(3 dak/RT)
%50 (1 dak/RT)
%100 (1 dak/RT)
0,5 sucrose to BS (5 min /RT)
0,25 M sucrose to BS (5 dak/RT)
0,125 M surose to BS (5dak/RT)
BS (5 dak/RT/RT-3X)
Vitrification of human ovarian tissue: Effect
of different solutions and procedures
•
•
•
•
•
•
% of normal morp. Follicle
FRESH:%97,7
FRESH+IVC:%98
VS1:92%
VS2:88%
VS3:94%
Vitrification of human ovarian tissue: Effect
of different solutions and procedures
• PLASTIC STRAWS
• VS DROPLETS
• SSV
•
•
•
•
•
FRESH:81%
FRESH+IVC:85%
STRAWS:32%
VS DROPLETS:60%
SSV:32%
SONUÇ
• OTF kemoterapi veya radyoterapi öncesi
üreme yeteneklerinin korunmasını isteyen
hastalar için umut olmaktadır.
• Gelecekte prematür over yetmezliğini önleme
ve doğurganlık sürecini uzatma gibi farklı
uygulama alanlarıbulacaktır.
• Uygun vitrifikasyon sıvıları ve carrier
sistemleri ile sonuçların çok daha
iyileştirilmesi mümkündür.
Oocyte cryopreservation
Ne zaman ve nasıl?
Medical Sebepler
Malignant Hastalıklar
Surgical ovary removal
Polycystic Ovary Hyperstimulation sydrome
İşlem Günü Yeterli Sperm Bulunamaması
M II oosit
VİTRİFİKASYON
• Solüsyon düşük ısıda soğutulurken
viskositesini aşırı derecede
yükselterek sıvı formdan camsı forma
geçirmektir.
• Canlı hücrenin stoplazmasındaki
suyun viskozitesi attırılarak kristal
yerine camsı forma geçmesi sağlanır.
M II oosit
Kontrollü Dondurma ve/veya
vitrifikasyon
Prospektif randomize çalışma sonuçları
farklılık göstermemekte
(Rienzi et al.,2010)
Klinik gebelik oranları vitrifikasyon yöntemi
ile 2 katına çıkmakta
(Tulandi et al.,2008)
M II oosit
Kontrollü Dondurma ve/veya
vitrifikasyon
Vitrifikasyon
Yavaş Dondurma
Sıvı penetrasyonunun kontrolü
Evet
Hayır
Dehidrasyon oranının kontrolü
Evet
Hayır
İnkübatör dışındaki süre
10 dakika
3 saat
Uzatılmış ısı şoku
Hayır
Evet
Zona Pellucida parçalanması
Hayır
Mümkün
Buz kristalleri oluşumu
Hayır
Mümkün
Malzeme ve masraflar
Ucuz
Pahalı
Cryotolarance
Yüksek
Düşük
Cryotoksisiti
Düşük
Yüksek
Kuleshova ve Lopata
2002, Fertility&Sterility
M II oosit
Kontrollü Dondurma
Oosit Kriyoprezervasyonu
Slow Freezing
Oosit
Vitrifikasyonu
Mekanik Hasar
Yavaş dondurma
Vitrifikasyon
RT
Seeding
-6°C
0.3°C/mi
n
Dengeli
dondurma
-35°C
LN2
LN2
Kristalizasyon
şekil değişikliği
buz kristalleri nedeni ile oluşan mekanik hasar
yüksek
düşük
Vitrifikasyon
Yüksek Kons. KP
RT
Yüksek soğutma oranı
2.000°C -20.000°C/min
Yüksek viskosite
Sıvı
Nitrojen
Vitrifikasyon düşük ısıda solüsyonun buz kristalleri oluşmadan
katılaşmasıdır. Kolay, ucuz ve hızlı bir yöntemdir.
Yavaş Dondurma
Vitrifikasyon
Programlı Cihaz
Kriyoprotektan ile dengeleme
RT
Dewar Konteynır
Kriyoprotektan ile dengeleme
RT
2°C/dak.
Soğuma hasarı
-6°C
seeding
Yavaş soğutma
oranı
-35°C
LN2
süre
Sıvı nitrojen içerisine
yerleştirme
Sıvı nitrojen
içerisine daldırma
Matür Oosit (M II) Kriyoprezervasyonu
YAVAŞ DONDURMA
PR 4% IR 0.1% (Chen 1986)
PR 8% IR 1% (Porcu 1998)
PR 17%
IR 14% (Porcu Taormina 2002)
MII oositlerin
kriyoprezervasyonunda
başarısızlığa neden olan faktörler
•
Oosit kalitesi (membran geçirgenliği !!!)
•
Klasik IVF sonrası düşük fertilizasyon
•
Düşük canlılık oranı (%25-40)
•
Yüksek anöploidi
•
Embriyoların gelişim özellikleri
Klasik inseminasyon sonrası düşük fertilizasyon (%20 – %30)
ZP’nin geri dönüşümü olmayan şekilde sertleşmesi
ÇÖZÜM: ICSI ZP sertleşme problemini ortadan kaldırır
ICSI sonrası döllenme oranı (%50 – %60)
Porcu 1997, 1998, Tucker 1998, Borini 1998 Fabbri 2001
Soğuma hasarı
0°C’de dengeleme
37°C
37°C
Fizyolojik
Fizyolojik
olmayan
°C)
olmayan ısı ((°C)
2°C/
dak.
2°C/dak.
ı
s
ı
(
0°C
0°C
--6°C
6°C
Zenzes FS 2001
• Tubulin depolimerizasyonunun kaybolması sonucu kromozomların ayrılma
hataları (repolimerizasyon anomalisi). Sonuç: Anöploidi artışı
• Sitoplazma yapısı, organeller ve moleküler hareketlerde meydana gelen
değişiklikler. Sonuç: Mayoz, fertilizasyon ve polarizasyon anomalisi
Yavaş Dondurma (PROH 1.5M –SUC
0.3M)
Son zamanlarda gerçekleştirilen uygulamalarda oositler için verimli ve
etkili bir metod olduğu gözlenmiştir. Artan gebelik sayıları bu yöntem
kullanılarak oluşturulan oosit bankalarının güvenli olduğuna işaret
etmektedir.
261 siklus
%60-80 survival rate,
ICSI ile yüksek fertilizasyon (%60-64)
Yüksek klivaj oranları (>%90)
IR 14%,
46 gebelik PR (%17)
(Porcu, Taormina 2002)
Canlılık gösteren oositlerin %60’ında spindle organizasyonu
normal olarak gözlenmiştir. Sitogenetik ve floresan teknikleri
ile yapılan araştırmada dondurma işlemine bağlı anöploidi
artışı gözlenmemiştir
Gook 1993 ve Van Blerkom 1994
Dondurma-çözme
işlemi
sorası
FISH
analizi
yapılan
embriyolarda gözlenen kromozomal anomalili embryo oranı
(%29) kontrol sikluslarından farklı bulunmamıştır (%26)
Cobo et al. (2OO1)
Taze ve Dondurulup Çözülüp
Oositlerin Laboratuvar Sonuçları
Oosit fizyolojisi ve moleküler
Göstergelerin Analizi
Oosit Güvenliği
Oosit Güvenliği
Taxol kullanımı: Hücre iskeleti sabitleyici
Erimiş Nitrojende dondurulma: -210 0 C de dondurma
Sodyum tüketen besiyeri: İmmatür oosit dondurulmasında
sodyum yerine Choline kullanılması
SONUÇ
Yükek konsantrasyonda dondurma çözeltileri ve aşırı soğutmayı sağlayan
vitrifikasyon teknikleri daha basit ve güvenli bir tekniktir.
Böylelikle ooplasmada buz kristallerinin oluşumu engellenir.
Vitrifikasyon sonrası yüksek canlılık, devam etme oranı, fertilizasyon, klivaj,
blastosist oranı Ve normal kromozomal yapılar elde edilmiştir.
Daha yüksek devam eden gebelik ve canlı doğum oranları gözlenmiştir.
SONUÇ
Ne varki daha etkili, güvenli ve optimal
sonuçlar için çalışmalar sürdürülmektedir
TEŞEKKÜRLER