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EFECTO DEL CONSUMO MODERADO DE VINO
SOBRE LA MICROBIOTA DE LA CAVIDAD BUCAL
Raquel Tabasco, Elvira Barroso, Tomás García-Cayuela, Irene Muñoz, M. Victoria Moreno-Arribas, Begoña
Bartolomé, M. Carmen Martínez-Cuesta, Carmen Peláez y Teresa Requena
Departamento de Biotecnología y Microbiología de Alimentos. Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación,
CIAL (CSIC-UAM). Nicolás Cabrera, 9. Campus de Cantoblanco, 28049 Madrid. E-mail: [email protected]
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO
La cavidad bucal está compuesta por cientos de especies de microorganismos diferentes, siendo en su mayoría bacterias, aunque aproximadamente
sólo el 50% de estas especies se pueden cultivar. Diversos estudios han demostrado que existe un efecto entre los componentes del vino y la salud
bucal, sin embargo, apenas existe información acerca de la modulación bacteriana por parte de los polifenoles del vino en la cavidad bucal.
El objetivo de este trabajo ha sido estudiar los posibles efectos del consumo moderado de vino tinto sobre la microbiota de la cavidad bucal a través
de un estudio de intervención en humanos.
MATERIALES Y MÉTODOS
A partir del ADN de las muestras de saliva obtenidas de un grupo de individuos sanos que habían estado consumiendo vino de forma moderada durante 28 días, se
realizaron análisis de la población microbiana a través de la separación de los fragmentos amplificados por PCR mediante electroforesis en gel de gradiente
desnaturalizante (DGGE), así como la cuantificación relativa de las diferentes poblaciones bacterianas por PCR cuantitativa (q-PCR).
ESTUDIO DE INTERVENCIÓN
Individuos sanos de ambos sexos
Edad: 25-45 años
No fumadores
Sin tomar antibióticos en 6 meses
• Periodo de lavado (15 días)
• Periodo de consumo de vino
(250 ml/día) durante 28 días
Tabla 1. Lista de cebadores para DGGE utilizados en este estudio.
Microorganismos
MUESTRA DE
SALIVA
Recogida de muestras:
Enjuague bucal con 15 ml de agua
Centrifugación y recuperación del sedimento
celular.
Extracción del ADN genómico total:
Rotura mecánica con bolas de vidrio
Incubación a 70 ºC con buffer de lisis
Kit NucleoSpin® Tissue
Secuencia 5´- 3´
Tamaño de
amplicón (bp)
Gradiente (%)
450
30-60
400
30-50
500
nested
500
40-55
F: AACGCGAAGAACCTTAC+ GC
Bacterias totales
R: CGGTGTGTACAAGACCC
F: GGAAACAGGTGCTAATACCG
R: ATCGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC +GC
Lactobacillus
F: GTTTGATCCTGGCTCAG
R: CACCGCTACACATGGAG
F: GGGTGGTAATGCCGGATG
R: GCCACCGTTACACCGGGAA +GC
Bifdobacterium
F: CGGGTGCTICCCACTTTCATG
R: GATTCTGGCTCAGGATGAACG
F: AGATGGACCTGCGTTGT +GC
Streptococcus
R: GTGAACTTTCCACTCTCACAC
F: A(C/T)CAACCTGCCCTTCAGA
Veillonella
R: CGTCCCGATTAACAGAGCTT +GC
F: CTGGCGCGGTATGGTCGGTT
Neisseria
R: GCCGACGTTGGAAGTGGTAAAG +GC
Prevotella, Porphiromonas, F: GAACGCTAGCTACAGGCTT +GC
Bacteroides
R: CCAATGTGGGGACC
1400
nested
550
25-50
343
40-70
103
30-70
276
40-58
Tabla 2. Lista de cebadores empleados en el estudio y eficiencias
obtenidas con cada pareja de cebadores
Microorganismos
Secuencia 5´- 3´
Tamaño de
amplicón (bp)
Eficiencia de
primers (%)
142
86,8
230
90
593
120,5
550
95,9
343
95,3
140
92,6
103
109,4
273
81,5
135
97,1
124
94,3
F: CGGTGAATACGTTCYCGG
Bacterias totales
R: GGWTACCTTGTTACGACTT
F: TGGAAACAGRTGCTAATACCG
Lactobacillus
R: GTCCATTGTGGAAGATTCCC
F: CTCCTGGAAACGGGTGG
Bifidobacterium
R: GGTGTTCTTCCCGATATCTACA
F: AGATGGACCTGCGTTGT
Streptococcus
R: GTGAACTTTCCACTCTCACAC
F: A(C/T)CAACCTGCCCTTCAGA
Veillonella
R: CGTCCCGATTAACAGAGCTT
Prevotella, Porphiromonas, F: GGTGTCGGCTTAAGTGCCAT
CGGA(C/T)GTAAGGGCCGTGC
Bacteroides
F: CTGGCGCGGTATGGTCGGTT
Neisseria
R: GCCGACGTTGGAAGTGGTAAAG
F: C(A/T)AACGCGATAAGTAATC
Fusobacterium
R: TGGTAACATACGA(A/T)AGGG
F: CTCCTACGGGAGGCAGCAG
Actinomyces
R: CACCCACAAACGAGGCAG
F: GGAGTGGGTTGTACCAGAAGTAGAT
Haemophilus
R: AGGAGGTGATCCAACCGC
RESULTADOS
Perfiles microbianos de saliva obtenidos por PCR- DGGE
Los perfiles microbianos de la saliva de los individuos antes y después del consumo moderado de vino, obtenidos por PCR-DGGE, no mostraron relación entre el
consumo de vino y los perfiles de bandas. Las diferencias encontradas indican mayor variabilidad entre individuos que la que podría asociarse al consumo de vino.
1
a
2
d
a
3
d
a
4
d
a
5
d
a
6
d
a
7
d
a
1
8
d
a
d
a
2
d a
3
d
a
4
d a
5
d
a
6
d a
7
d a
d
1
8
a d
a d
2
a d
3
4
a d
a d
5
a
6
d a
7
d
a
8
d a
d
S
Fig.2. PCR-DGGE con cebadores específicos para
Streptococcus.
Fig.1. PCR-DGGE con cebadores de bacterias totales
Carriles 1, 2, 3 y 8: antes (a) y después (d) del periodo de
consumo moderado de vino.
Carriles 4, 5, 6 y 7: controles (no consumidores de vino)
Se observa una banda mayoritaria y presente en todos los
individuos, cuya secuenciación permitió su identificación
como S. mitis - S. oralis, que se corresponde con
estreptococos del grupo viridans, predominantes en la
cavidad bucal.
Fig.3. PCR-DGGE específicas para Veillonella
El perfil de bandas obtenido para Veillonella muestra una
mayor diversidad bacteriana, al igual que se observó en
Prevotella, Porphiromonas, Bacteroides y Neisseria, géneros
mayoritarios en la cavidad bucal.
Cuantificación de la microbiota bucal mediante q-PCR
Voluntarios
Log ufc/ml ± desv. est
INICIO
Log ufc/ml ± desv. est
FINAL
Consumidores vino
8,37 ± 1,09
8,40 ± 1,56
Voluntarios controles
7,92 ± 1,16
7,70 ± 0,81
Los resultados del análisis por q-PCR
de los géneros bacterianos, antes y
después del consumo de vino,
mostraron
diferencias
en
la
proporción relativa de Streptococcus
(P=0,042), Neisseria (P=0,003) y
Actynomices (P=0,003), asociadas al
consumo moderado de vino.
Controles
Tabla 4. Resultados obtenidos de los ratios relativos de cada especie después de los 28 días de estudio en
ambos grupos de voluntarios. La cuantificación relativa se calculó de acuerdo al método de Pftaffl et al. (2002).
Consumidores
de vino
Tabla 3. Resultados obtenidos de la cuantificación de
bacterias totales en saliva, empleando cebadores universales
y una recta de calibrado con diluciones decimales de ADN de
un cultivo puro de E. coli (Eficiencia = 93,3%, r2= 0,995, slope=
-3,493). Los resultados estadísticos (Student- t) no mostraron
diferencias significativas en el número total de bacterias de la
saliva debido al consumo moderado de vino.
Voluntarios Lactobacillus Bifidobacterium Streptococcus Veillonella
V5
0,64
0,86
0,87
0,75
V6
0,73
ND
1,04
0,68
V7
0,71
0,85
0,83
0,75
V8
0,84
0,38
0,71
2,27
V9
1,08
1,41
1,17
1,41
V16
0,63
1,26
0,71
0,62
V17
1,24
1,31
1,13
1,01
V28
1,21
3,87
1,30
0,57
Media ± D.E. 0,88 ± 0,25
1,42 ± 1,14
0,97 ± 0,22
1,01 ± 0,58
Prevotella
1,36
0,58
1,70
1,47
1,59
0,44
0,79
0,90
1,10 ± 0,49
Neisseria Fusobacteria Actynomices Haemophilus
2,23
1,80
0,64
1,08
0,83
0,53
1,06
1,71
0,60
0,93
0,12
0,46
6,82
1,92
ND
1,00
0,55
1,51
0,97
0,94
0,60
1,56
ND
3,74
0,88
0,73
1,01
0,78
1,93
0,66
1,22
1,56
1,80 ± 2,13
1,20 ± 0,55
0,84 ± 0,40
1,41 ± 1,02
Voluntarios Lactobacillus Bifidobacterium Streptococcus Veillonella
V1
0,90
0,47
1,08
1,36
V2
1,97
1,66
2,08
1,51
V10
1,06
ND
1,25
0,98
V11
0,64
ND
0,95
1,15
V12
1,11
ND
0,72
0,70
V13
1,16
1,32
1,51
2,24
V14
0,91
0,59
0,76
0,81
V15
0,99
0,46
0,28
0,57
V18
0,73
0,35
0,76
0,32
V19
1,08
1,58
1,06
1,02
V20
1,25
1,60
1,22
0,66
V25
0,67
0,37
0,79
2,07
V26
1,05
3,05
0,96
1,66
V27
0,76
1,48
0,71
0,80
Media ± D.E.
1,02± 0,33
1,17 ± 0,83
1,01 ± 0,43
1,13 ± 0,57
Prevotella
1,22
2,46
0,83
0,59
0,75
0,73
0,79
1,01
1,01
0,83
0,98
2,32
0,99
1,03
1,11 ± 0,57
Neisseria Fusobacteria Actynomices Haemophilus
1,60
1,33
2,11
0,67
0,62
2,07
ND
1,68
0,55
1,00
ND
3,18
0,27
0,68
0,68
1,10
2,80
0,66
4,71
0,86
0,40
1,19
5,01
0,51
1,67
0,49
0,72
1,04
0,46
0,62
3,54
0,47
2,82
1,48
1,12
2,68
0,66
0,66
0,73
0,50
0,81
0,82
0,90
0,63
1,10
1,70
0,94
0,85
1,36
0,64
0,67
1,70
2,31
0,89
0,66
1,34
1,24 ± 0,88
1,02 ± 0,47
1,82 ± 1,65
1,23 ± 0,83
ND: no detectado
D.E.: Desviación estándar
CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos mediante PCR-DGGE muestran diversos patrones de comunidades bacterianas entre individuos, que se mantienen
estables e independientes del consumo moderado de vino. La cuantificación de bacterias totales mediante q-PCR se mantiene constante tras
el consumo moderado de vino, sin embargo, los géneros Streptococcus, Neisseria y Actynomices muestran diferencias significativas en la
proporción relativa frente a los voluntarios que no consumieron vino.
Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación (proyectos AGL2009-13361-C02-00 y CSD2007-00063 Consolider Ingenio 2010 FUN-C-FOOD), la Comunidad de Madrid (proyecto ALIBIRD P2009/AGR-1469) y CYTED (IBEROFUN 110AC0386).
Raquel Tabasco agradece al Instituto Danone la concesión de una beca de investigación.